丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养_王艳红

Ａｐｒｉｌ２００７

２００７年４月文章编号

（２００７）０２－０１６１－０５１００５－９３６９

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养

王艳红，龚束芳，车代弟＊

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨

１５００３０）

摘要：分别以丰花月季叶片、叶柄和茎段为外植体诱导出愈伤组织，并建立细胞悬浮系。结果表明，丰花

月季叶片和茎段是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体；诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是・・・ＮＡＡ４ｍｇＬ－１＋２，４－Ｄ１ｍｇＬ－１＋ＢＡ１ｍｇＬ－１；细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为１．５×１０４～３．０×１０４个・ｍＬ－１时；继代培养４～５代时，可得到稳定的悬浮细胞系。

关键词：丰花月季；组织培养；细胞悬浮培养；松散型愈伤组织中图分类号：Ｓ６８５．１２；Ｓ５／５９｜０３５．３｜

文献标识码：Ａ

丰花月季（ＲｏｓａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＶａｒ．ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）是蔷薇科，蔷薇属，多年生木本花卉，在切花、园林美化、盆栽等多个领域均占有重要地位，具有极高的商业价值［１］。目前，世界各地栽培的月季均是以中国月季为亲本，经长期不断的选育和反复杂交，有限的基因来源大大地限制了新品种的出现，常规育种已无法满足需要［２－５］。近些年来，随着生物技术与分子生物学技术的迅速发展，国外许多研究者开始借助分子生物技术改良现代月季的某些品质［６－１３］。我国在月季生物技术与分子生物学研究上，多是在组织培养等方面取得一定进展，在丰花月季细胞悬浮培养方面尚未见报道［１４］。因此本研究在获得丰花月季松散型胚性愈伤组织的基础上，进行了丰花月季悬浮细胞培养研究，以期进一步用于建立丰花月季原生质体再生体系及原生质体或微原生质体融合体系，为月季遗传转化、细胞突变体筛选、优良无性系的繁殖和人工种子制作等领域的研究奠定基础。

１．２１．２．１

方法

丰花月季愈伤组织的诱导

无菌外植体的获得

１．２．１．１

接种材料为当年抽生侧芽饱满的幼嫩茎段，自来水冲洗１０～２０ｍｉｎ；７５％乙醇浸泡３０ｓ，０．１％升汞表面消毒３ｍｉｎ，无菌水冲洗４～５次，将侧芽切下接种在ＭＳ基本培养基上，获得无菌苗备用［１５－１６］。

１．２．１．２

愈伤组织的诱导

取无菌苗叶片切成约０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的小块，叶柄、茎段切成小段。为了研究几种常用植物激素对月季愈伤组织诱导的影响，我们选取ＢＡ，ＫＴ，（因素），每个因素设３ＮＡＡ和２，４－Ｄ等４种激素

个水平进行激素的初步筛选，见表１［６］。诱导和继代培养均在黑暗条件下进行，培养温度为２５℃，３￣４周更换１次培养基。３次重复。

表１

愈伤组织诱导正交设计方案

・ｍＬ－１）Ｔａｂｌｅ１Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｐｒｏｊｅｃｔｏｆｃａｌｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｍｇ

水平

因素Ｆａｃｔｏｒｓ

１

１．１

材料与方法

材料

所用材料由东北农业大学园林系月季育种课

Ｌｅｖｅｌｓ１２３

ＢＡ０１２

ＫＴ０１２

ＮＡＡ０２４

２，４－Ｄ０１２

题组提供。

收稿日期：２００５－０９－２１

基金项目：哈尔滨市科技攻关项目（２００５ＡＡ６ＣＮ０７１）

作者简介：王艳红（１９８０－），女，山东，硕士，研究方向为园林植物分子植物育种。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｇ－０９＠１６３．ｃｏｍ

１．２．２丰花月季细胞悬浮系的建立

将分散性好、疏松的愈伤组织，接种在与继代

＊通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｄａｉｄｉｃｈｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

・１６２・东北农业大学学报第３８卷

培养基相同的液体培养基中，每１５０ｍＬ的三角瓶中加入液体培养基４０ｍＬ，摇床转速为１１０ｒ・ｍｉｎ－１，温度２５℃。每隔１０ｄ继代１次，连续培养４～５代后逐渐形成稳定的细胞系。每隔１ｄ在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相，进行细胞计数，以建立细胞数量生长曲线。

处理

表２正交研究方案及结果

Ｔａｂｌｅ２Ｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆ

ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

因素Ｆａｃｔｏｒｓ

诱导率（％）

Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ

１２３４５６７８９Ｋ１Ｋ２Ｋ３ｋ１ｋ２ｋ３Ｒ

ＢＡ０００１１１２２２１５０９０４０５０３０１３．３３６．７

ＫＴ０１２０１２０１２２０１１５１４５６．７３８．３４８．３４１．７

ＮＡＡ０２４２４０４０２５５１３０９５１８．３４３．３３１．７２５

２，４－Ｄ０１２２０１１０２２５１５５１００８．３５１．７３３．３４３．３

Ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ

ｒａｔｉｏ

０９０６０１０２５５５１００３０

１．２．３细胞悬浮生长曲线的测定

取０．５ｇ悬浮培养物，接入新鲜液体培养基中，

进行振荡培养，每隔１ｄ取样１次，共培养１３ｄ，连续做３次平行实验。

１．２．４悬浮细胞数目的测定

用血球计数板法对悬浮细胞计数，每个结果为

４次平行实验的平均值。

细胞数按下面公式计算：１ｍＬ悬浮液中的总细胞数＝Ａ／５×２５１０４×Ｂ（Ａ为５个中方格总细胞数，

Ｂ为稀释倍数）。

２

２．１

结果与分析

外植体对愈伤组织状态的影响

不同外植体的脱分化能力不同，诱导出愈伤

组织的频率和愈伤组织的状态也存在较大差异。在丰花月季愈伤组织诱导时，本实验采用三种外植体：叶片、叶柄和茎段。

经过３０ｄ观察发现，两种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织。结果表现为：以叶片和茎段为外植体诱导得到的愈伤组织形态上差异不明显，愈伤组织多数呈乳黄色，部分呈绿、白色，松散程度不一，叶片诱导率稍高于茎段能达到９０％以上，选取好的经２～３代的继代培养可获得较疏松的，适宜于细胞悬浮培养的愈伤组织；叶柄为外植体主要是在基部及切口处形成愈伤组织，接种后生长极其缓慢，接１０ｄ时可见边缘切口处发生褐化，得到的愈伤组织少；因此认为叶片和茎段是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体。

由表２结果可见，单独使用细胞分裂素没有愈伤组织形成，对正交研究进行极差分析，各因素对愈伤组织诱导率的影响作用：２，４－Ｄ浓度＞ＫＴ浓度

＞ＢＡ浓度＞ＮＡＡ浓度。最佳愈伤组织诱导组合是：

・・・ＫＴ２ｍｇＬ－１＋ＮＡＡ２ｍｇＬ－１＋２，４－Ｄ１ｍｇＬ－１。

继代２￣３次后获得的愈伤组织基本可分为三类：黄色胚性愈伤组织、黄色非胚性愈伤组织、绿色非胚性愈伤组织。以黄色胚性愈伤组织质量为最好。没有生长素组合上继代获得绿色非胚性愈伤组织（见图版Ⅰ－１），它生长缓慢，硬度较大；有生长素组合上继代获得黄色非胚性愈伤组织（见图版Ⅰ－２），它生长旺盛，含水量大，比较坚硬。转接到２，４－Ｄ０．５ｍｇ・Ｌ－１＋ＢＡ１ｍｇ・Ｌ－１组合中可获得黄色胚性愈伤组织（见图版Ⅰ－３），它质地松软，有利于细胞悬浮培养。

２．２激素对愈伤组织形态的影响

不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组

２．３继代次数与细胞形态之间的关系

继代过程中，细胞悬浮液的颜色、细胞的形

织的状态、质地和分散性，而这些因素又是松散愈伤组织的关键，也是进行细胞悬浮培养的必要前提。因此，本实验诱导月季愈伤组织及继代培养设计了９种激素组合正交研究结果见表２。

态、大小、数量不断在发生着变化。第１，２次继代时，细胞悬浮液为白色混浊，有许多大颗粒，倒置显微镜下观察，细胞多数成团，保持较旺盛的分裂能力（见图版Ⅰ－４），单细胞大多呈长形、梭形、

第２期王艳红等：丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养・１６３・

不规则形，细胞个体较大；３，４次继代时，细胞悬浮液变为黄色，比较粘稠，颗粒大小分布均匀，倒置显微镜下观察，分裂的细胞团增多，有的细胞团明显可见有２０～３０个球形细胞组成，单细胞数目增多，而且大多呈球形；５次继代时，细胞悬浮液呈透明的黄色，澄清，呈油状流动（见图版Ⅰ－５），

颗粒分布很均匀，直径大多在０．５～１ｍｍ，倒置显微镜下观察，细胞团和单细胞很多，大多呈球形（见图版Ⅰ），大小均匀；６，７次继代以上时，悬－６浮液变得比较澄清，呈浅黄色，倒置显微镜下观察，多数是由小细胞团和少量单细胞组成的悬浮培养物（见图版Ⅰ－７）。

（２０×）；５－球形细胞（２０×１－胚性愈伤组织；２－黄色非胚性愈伤组织；３－绿色非胚性愈伤组织；４－大的细胞团）；

６－分散性良好的悬浮细胞系；７－黄色的细胞悬浮液；８－愈伤组织萌发出芽；９－完整植株

）；５－Ｇｌｏｂａｌｃｅｌｌ１－Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｌ；２－Ｎｏ－ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃａｌｌｕｓｗｉｔｈｙｅｌｌｏｗｃｏｌｏｒ；３－Ｎｏ－ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃａｌｌｕｓｗｉｔｈｇｒｅｅｎｃｏｌｏｒ；４－Ｂｉｇｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓ（２０×

（２０×）；６－Ｗｅｌｌ－ｓｃａｔｔｅｒｅｄｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ；７－Ｙｅｌｌｏｗｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ；８－Ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｈｏｏｔｏｆｃａｌｌｕｓ；９－Ｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

图版Ⅰ月季胚性细胞悬浮培养及再生植株

ＰｌａｔｅⅠＰｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓｉｎｒｏｓｅ

因此，继代培养过程中，随着继代次数的增多，细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色，由混浊变为澄清、透明，颗粒大小由不均匀到均匀，最终直径在０．５～１ｍｍ，倒置显微镜下观察，单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形，细胞系逐渐趋于稳定。

随后，我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的ＭＳ培养基上，１０ｄ后长出新的愈伤（见图组织，３０ｄ后长出月季全苗并转入蛭石成活版Ⅰ－８，９），说明以细胞系转化为新的愈伤组织生成再生植株是成功的。

系生长的影响结果见表３。

表３不同起始密度对悬浮细胞系生长的影响

Ｔａｂｌｅ３Ｔｈｅｖａｒｉｅｔｙｏｆｃｅｌｌｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｉｔｉａｌ

ｄｅｎｓｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｄａｙ

培养密度

（个・ｍＬ－１）细胞数减少

时间（ｄ）

增长率（％）备注

Ｃｕｌｔｕｒｅｄｅｎｓｉｔｙ１．０×１０３０．５×１０４１．５×１０４３．０×１０４８．０×１０４

Ｔｉｍｅ

ＩｎｃｒｅａｓｅｒａｔｅＲｅｍａｒｋ不能增殖

１３１２１０９

８７４．１６６５．４５４７．３３６４．７

悬浮液呈

浅黄色悬浮液呈黄色、透明悬浮液呈黄色悬浮液有些混浊

２．４细胞起始密度对细胞悬浮培养的影响起始密度过大过小不仅会影响细胞系筛选的时

间而且不利于稳定细胞系的建立，对细胞培养周期也有影响。比较不同培养密度对丰花月季悬浮细胞

・１６４・东北农业大学学报第３８卷

从表３可见，培养密度对月季悬浮细胞系生长有很大影响，能正常继代增殖的起始密度是０．５×

过大，培养基营养耗尽。可以得出结论：进行月季细胞悬浮培养的最佳起始密度为１．５×１０４～３．０×１０４个・ｍＬ－１，其培养周期为１１ｄ。

［

参

考

文

献

１０４个・ｍＬ－１，低于它，则小细胞团和单细胞很难增

殖，只有较大的细胞团会继续生长，只能得到很大的颗粒；高于０．５×１０４个・ｍＬ－１每瓶的培养物生长量随接种量的增加而递增，达到最大密度所需的时间也随之缩短，而增长率却随之下降，这是由于在高密度下培养养分很快消耗殆尽的结果。这表明，从保持悬浮细胞系的角度看，适宜的接种密度为０．５×１０４～１．５×１０４个・ｍＬ－１；如要尽快获得大量悬浮培养物的角度看，适宜的接种密度为

］

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３．０×１０４个・ｍＬ－１。２．５

悬浮细胞系的生长曲线

丰花月季悬浮细胞系生长动态大致呈“Ｓ”形曲线（见图１）。

［５］［４］

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不同起始密度的细胞在进行细胞悬浮培养时，一个培养周期内各个时期的长短和到达对数生长期时间是有差别的。细胞起始密度为０．５×１０４个・ｍＬ－１时，细胞延迟期较长约３～５ｄ，可能是细胞首先需要聚集到一定密度，生长才比较明显。７ｄ达到对数生长期，但持续时间很短，只有一天，然后细胞数开始减少，１１ｄ时细胞衰退；细胞起始密度为

ｖｉｔｒｏｇｒｏｗｎｌｅａｆｅｘｐｌａｎｔｓｏｆＲｏｓａｈｙｂｒｉｄａＬ［Ｊ］．ＪＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃ－ｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，５（３）：１６９－１７２．

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１．５×１０４～３．０×１０４个・ｍＬ－１时，１￣３ｄ为细胞延迟

期，细胞增值比较缓慢，５ｄ后，细胞开始迅速增长，７～９ｄ达到对数生长期，此时细胞数目增殖近

２５倍，达到最高峰，９～１１ｄ为细胞生长减慢期，在

此期间，细胞数目增长缓慢；细胞起始密度为８．０×・１０４个ｍＬ－１时，细胞延迟期较短只有１～２ｄ，７ｄ达到对数生长期，但细胞数目增殖不到６倍，９ｄ时，细胞增长缓慢，并很快衰退，可能是由于细胞密度

第２期王艳红等：丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养・１６５・

［１５］项艳，江海洋，李卞宗．正交试验法在月季离体快繁中的应用［Ｊ］．

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Ｓｔｕｄｙｏｎｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ

ｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｒｏｓｅ（Ｒｏｓａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）

ＷＡＮＧＹａｎｈｏｎｇ，ＧＯＮＧＳｈｕｆａｎｇ，ＣＨＥＤａｉｄｉ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｗｅｒｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃａｌｌｕｓｔｉｓｓｕｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍｌｅａｆ，ｌｅａｆｓｔａｌｋａｎｄｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔｓｏｆＲｏｓａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｂｏｔｈｌｅａｆａｎｄｓｔｅｍｅｘｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．ＦｒｉａｂｌｅｃａｌｌｕｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｈｅｎｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ（ＭＳ）ｍｅｄｉｕｍＬ－１ＮＡＡ，１ｍｇ・Ｌ－１２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（２，４－Ｄ），１ｍｇ・Ｌ－１６－ｂｅｎｚｙｌ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ４ｍｇ・

・ａｄｅｎｉｎｅ（６－ＢＡ）．Ｔｈｅｂｅｓｔｏｒｉｇｉｎａｔｉｏｎｄｅｎｓｉｔｙｗａｓ１．５×１０４－３．０×１０４ｎｕｍｂｅｒｍＬ－１；ａｆｔｅｒ４－５ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｓｕｂ－

ｃｕｌｔｕｒｅ，ｓｔａｂｌｅｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｏｓａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ；ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓ；ｆｒｉａｂｌｅｃａｌｌｕｓ