新型脂肪胺检测荧光衍生试剂的合成及应用

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新型脂肪胺检测荧光衍生试剂的合成及应用

孔　滨

（曲阜师范大学 实验教学与设备管理中心，山东　曲阜　273165）

摘　要：合成了新型荧光试剂1-（1H-咪唑-1-基）-2-（2-苯基-1H-菲并）-[9,10-d] 咪唑-1-基）-乙酮（HPIE），

并应用与标准样品中的12种脂肪胺发生衍生化反应，利用Eclipse Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm, 5 µm）进行反向梯度洗脱，分离衍生物并进行荧光检测。最佳实验条件：以乙腈为溶剂，HPIE与总脂肪胺的摩尔比值为4，80°C下，衍生化反应时间10min后获得稳定的荧光产物。结果显示，HPIE-胺衍生物的出峰信号稳定，线性相关系数大于0.9990，准确度、精密度和回收率高，检测限范围为：0.0022-0.0087ng/mL，灵敏度高，适用于分析环境样品中痕量脂肪胺。

关键词：荧光检测；柱前衍生；脂肪胺文章编号：ISSN2096-0743/2019-02-0069

脂肪胺因毒性大、反应活性高等特点而备受环境检测部门关注。脂肪胺易与亚硝基化合物反应，产生具有潜在致癌性作用的N-亚硝胺类化合物，并且脂肪胺很容易从土壤和水中迁移。在生态循环过程中，脂肪胺对人类的身体健康造成很大威胁。因此，对环境样品中脂肪胺的含量进行精确检测，并控制其在环境中的存量具有重要意义。

然而，准确检测环境样品中脂肪胺存在一定困难：1）一些脂肪胺会被降解和稀释，因此只能在痕量水平上实施检测；2）由于脂肪胺的分子结构无紫外辐射和荧光性，痕量的脂肪胺无法直接被检测到，除非经过衍生化来提高敏感度才能做到；3）脂肪胺的碱性强、活性高和极性大，导致其萃取或色谱分析相对较难。其中灵敏度比较高的方法主要是应用了柱前衍生化技术。衍生化的实施需要优良的衍生试剂，如：OPA-NAC，BCEC-Cl，FMOC-Cl等。虽然这些试剂已被用于检测各种样品中的脂肪胺，但是它们还存在一些不足，例如灵敏度偏低和不稳定性。在前人研究的基础上，合成一种新型的荧光分子1-（1H-咪唑-1-基）-2-（2-借助经过衍生条件优化后的超声荧光探针衍生微萃取技术，结果发现，HPIE-胺分子具有强烈的荧光响应和离子流信号，该方法具有灵敏度高、选择性好和效率高等特点，HPIE可作为评价和控制脂肪胺含量的优良荧光分子探针。

检测器（FLD）（G1321A型号）和自动采样器（G1329A型号）。液相色谱/质谱联用仪（离子阱）1100型购自德国Bruker Daltonik 公司；采用Paratherm U2电子水浴器（Hitachi, 东京, 日本）控制温度。 

12种脂肪胺标样（C1-C12）购自上海化学试剂公司，C1-C12为：甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺、壬胺、癸胺、十一胺、十二胺；实验用水以Milli-Q超纯水净化系统(Millipore, Bedford, MA, USA)制得。

1.2 色谱及质谱条件

Eclipse Hypersil BDS C18色谱柱（4.6mm×150mm，5µm）。流动相A：30%乙腈溶液，进行反向梯度洗脱（0–22min,，90%到55%；22–26min，55%到15%；10mmol/L）（1000/7.5，v/v），流动相B为100%乙腈，流速控制在1.0mL/min，柱温设为30°C。流动相通过0.2mm滤膜（Alltech, Deerfiled, IL）；衍生物用荧光检测法（λex 260nm和λem 380nm）测定。

质谱条件：大气压化学电离（APCI）源，正离子检测方式，雾化压60 psi，干燥气体温度350°C，干电压350v。

1.3 合成1-（1H-咪唑-1-基）-2-（2-苯基-1H-菲并）-[9,10-d]咪唑-1-基）-乙酮（HPIE）

称取2g N, N’-羰二咪唑加入至100mL乙腈/二甲基亚砜溶剂中（v/v=1:2）。向所得溶液中加入3g 中间体PPIA后，对反应体系进行加热回流1h。冷却至室温后，将溶液转移至300mL冰水中，并剧烈搅拌10min；过滤析出物，水洗后，室温下风干48h。粗产品在乙腈溶剂中3次重结晶得白色晶体（合成路线如

截至目前，国内外已建立了多种检测脂肪胺方法[6-10]，26–33min，15%到0%，用甲酸/氨水作缓冲液（pH3.7，

苯基-1H-菲并）-[9,10-d] 咪唑-1-基）-乙酮（HPIE），燥气流量5.0L/min，电晕电流（nA）4000(pos)，毛细管

1.实验设计1.1仪器与试剂

安捷伦HP1100系列（Waldbron，德国）配以荧光

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图1所示）。产率：79%，熔点：266.6-268.2°C（分解点）。高效液相色谱-常压化学电离-质谱：m/z 403.1 +；MS/MS: m/z 295.7 (分子核部分)。

图1 HPIE的合成路线

1.4 12种脂肪胺的衍生化

在10 mL 二甲基甲酰胺（DMF）溶液中溶解40.5 mg HPIE，配成浓度为:1.0×10-2mol/L的衍生化试剂，用乙腈稀释选用。将适量12种脂肪胺标样加入乙腈中，配制成20mL浓度为1.0 × 10-3 mol/L的溶液储备待用（反应式如图2所示）。校准所需标准溶液通过乙腈稀释储备液制成，浓度范围为0.0001-180ng/mL。进行质量控制（QC）的溶液配成3个浓度水平：0.005 ng/mL，5 ng/mL和100ng/mL。将QC溶液和储备液分成小份，-20 °C避光储存，待用。

图2 HPIE衍生化反应式

2.结果与讨论2.1衍生条件的优化

影响HPIE与脂肪胺衍生化反应的条件主要有溶剂、衍生化试剂与脂肪胺的比例、温度和反应时间等。结果显示：对乙腈（ACN）、二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）和氯仿（CHF）四种有机溶剂进行筛选，在乙腈中的荧光响应比其它3种溶剂强，说明乙腈是获得高灵敏性的优选溶剂，被用于荧光光谱实验。观察10min到80min的检测范围内，壬胺始终保持较高的衍生效率，并且响应信号稳定（如图3），因此，只需将反应时间控制在10min即可实现对脂肪胺的选择性衍生提取和荧光检测。在其他条件一定的情况下，最佳衍生提取条件：HPIE与总脂肪胺的比例为4，温度80°C。 

图3 衍生时间对衍生提取产率的影响（壬胺）

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实验研究

2.2 HPIE-胺衍生物的荧光光谱和稳定性

将HPIE（1.0ml，1.0×10-2M）和过量脂肪胺反应，制备单一的HPIE-胺衍生物，利用半制备的高效液相色谱(HPLC)对所得体系进行分离。选择峰较低的HPIE-C1来探索洗脱效率与光谱波长位移和稳定性的匹配关系（如图4所示）。称取3mgHPIE-C1衍生物溶于30mL乙腈中，将溶液分成两小份。一份用来溶于

一些混合溶剂：1. DMF-H2O (1: 99 v/v); 2: DMF-H2O-ACN (1: 49: 50 v/v); 3: DMF-H2O-ACN (1: 29: 70 v/v); 4: DMF-H2O-ACN (1: 9: 90 v/v)，以乙腈和甲酸/氨水配成缓冲液(pH 3.7，10 mmol/L) (1000/7.5，v/v)；另一份储

存在4°C冰箱中，并隔一天观察一次，连续一周。

结果可见，随着乙腈和水的体积比增加（S2，S3，S4），荧光强度的响应信号显著增强，而在DMF-H2O (1: 99 v/v) (S1)体系中，荧光强度最弱（如图4所示）。这可能是由于HPIE中的N原子被H2O分子质子化降低了荧光强度。在对不同溶剂的样品进行高效液相色谱-荧光检测过程中，从S2，S3，到S4，最大激发和发射波长几乎未变化，说明，检测波长没有出现显著的红移或者蓝移。另外，所有的衍生物使用同一溶剂作为流动相A，隔一天观察一次，持续一周，未发现

明显变化。因此，HPIE-胺衍生物无论是在高效液相色谱-荧光检测过程中还是经过较长时间储存，其出峰信号都非常稳定。

图4 不同溶剂对激发(Ex)与发射波长(Em)的影响（S1. DMF-H2O (1: 99 v/v); S2: DMF-H2O-ACN (1: 49: 50 v/v); S3: DMF-H2O-ACN (1: 29: 70 v/v); S4: DMF-H2O-ACN (1: 9: 90 v/v)）

2.3 标准样品的色谱分离

将待测物的衍生物注入Hypersil BDS C18柱，以荧光检测器进行高灵敏度检测。如图5所示，过柱后分离效果良好，在32min内即可完成荧光检测。从图中可以看出，12种目标物实现了良好的分离。

图5 标准品脂肪胺衍生产物色谱分离荧光检测图

实验研究

2.4 线性与检测限

检测限（LOD）是反映方法灵敏度的指标，它的信噪比为3:1。每种脂肪胺校准用标液设7个浓度，每个浓度设3个重复，各自反应3天。对峰面积（Y）与注入浓度（X）进行线性回归分析，得到校正曲线。

如表1所示，12种待测物均呈现出较好线性规律，相关系数大于0.9990。线性范围较宽，可确保检测对象的普遍适用性。为进一步对定量过程进行评价，对荧光检测的峰面积进行了相对标准偏差（RSD，n=6）的计算。结果可见，RSD的分布范围在0.17%-0.67%，这说明定量的准确性高，检测结果的误差小。另外，本方法获得了较低的检测限，范围为：0.0022-0.0087ng/mL，说明检测的灵敏度高，因而非常适用于痕量分析。低检测限的获得主要归因于所设计HPIE荧光试剂有着较大的n-π共轭面，以此可增强其荧光强度。表1 线性方程、相关系数、线性范围、检测限、峰面积相

对偏差

脂肪胺Y = A*X +

相关系线性范围 (ng/检测限(ng/峰面积相对Ba数mL)mL)偏差 (%)C1Y = 866X +29.420.99900.026 ~ 60.180.0075 0.53C2Y = 4763X +

35.540.99910.004 ~ 86.650.0033 0.34C3Y = 2946X –

26.740.99930.005 ~ 118.80.0058 0.57C4Y = 3967X +

27.680.99950.005 ~ 100.10.0034 0.56C5Y = 2689X +

21.070.99940.005 ~ 121.10.0037 0.37C6Y = 3676X +

2.95

0.99920.008 ~ 115.90.0022 0.17C7Y = 6134X –

32.560.99970.006 ~ 123.70.0078 0.92C8Y = 4095X +

33.540.99980.008 ~ 106.50.0036 0.34C9Y = 2987X +

20.260.99910.005 ~ 122.40.0087 0.67C10Y = 3595X +

37.300.99930.007 ~ 138.10.0059 0.32C11Y = 3468X +

26.980.99970.034 ~ 100.50.0064 0.27C12

Y = 3254X +

26.26

0.9995

0.011 ~ 97.4

0.0057

0.64

aX：进样浓度（fmol）；Y：峰面积2.5准确度，精密度和回收率

分别对当天的样品和隔天的样品进行 3次质量控制水平上的重复测定，算出相对误差（RE%）和相对标准偏差（RSD%），确定实验的准确度和精密度（如表2所示）。由结果可以看出，代表准确度的RE%值范围为-3.33%至3.79%；代表批内和批间精密度相对标准偏差值的范围分别为0.15-4.83%和0.96-4.73%。这些指标说明本方法应用了HPIE荧光试剂可得到较高的准确度和较好的精密度。为探索待测物回收率指标，

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在3个不同检测浓度水平上对12种分析物进行了回收率测试，结果表明回收率范围在94.34%和101.16%区间，表明本方法中所用HPIE检测待测物并未受到基质的明显干扰，因此对于分析环境样品中痕量脂肪胺非常合适。

表2 准确度、精密度和回收率（n=6）

脂肪

准确度 (RE% ) a

胺

精密度 (RSD% ) b回收率 (% n=6) c

批内批间批内批间质控

(ng/0.0055

1000.005

5

1000.005

5

1000.005

5

100

mL)

C

12.07 1.24 -1.52 1.32 3.75 2.13 2.16 3.27 1.84 98.78 99.99 96.01 C2

1.80 2.28 0.88 1.53 2.83 2.58 3.04 2.58 2.58 96.09 96.57 101.16

C3-1.82 1.99 2.28 3.56 3.40 2.57 2.78 2.61 2.25 95.03 96.00 100.00 C42.09 -1.27 2.60 2.55 3.69 4.15 2.13 4.02 3.88 97.92 98.39 101.10 C5

3.45 -1.85 2.42 1.56 2.27 0.15 3.24 2.88 2.82 96.98 100.88 98.88

C6-3.33 2.11 1.70 3.45 2.82 3.56 3.56 4.25 0.96 94.74 98.49 97.34 C72.58 -1.63 2.72 3.96 4.83 2.78 4.73 3.17 3.50 94.82 100.01 99.69 C8

2.47 2.81 -2.50 2.78 3.77 3.77 2.02 2.10 3.19 96.57 99.16 94.84

C9-0.24 1.61 2.47 2.10 4.39 3.54 2.63 2.28 3.26 98.69 96.19 95.91 C102.82 1.60 2.48 1.55 3.40 2.28 3.10 1.05 3.20 94.34 95.03 98.98 C112.91 3.75 -1.80 4.25 2.48 4.11 2.68 2.61 2.68 101.06 99.16 96.67 C121.32 2.90 3.79 2.27 1.98 3.40 3.47 2.82 2.60 97.82 99.84 99.26

3.结论合成了一种新型荧光分子HPIE，对12中脂肪胺标准样品进行衍生化实验，并利用高效液相色谱-荧光法对HPIE-胺进行了检测，得到比较强的荧光响应信号，且衍生化合物经长时间储存仍很稳定。在优化条件下，脂肪胺经HPIE衍生化后进行检测，可获得高灵敏度、准确度、精密度和回收率。

参考文献：

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