马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的克隆和表达

维普资讯 http://www.cqvip.com 作物学报ＡＣＴＡ　ＡＧＲＯＮＯＭＩＣＡ　ＳＩＮＩＣＡ　２００８，３４（９）：１５１０—１５１７　ｈｔｔｐ：Ｈｗｗｗ．ｃｈｉｎａｃｒｏｐｓ．ｏｒｇ／ｚｗｘｂ／　ＩＳＳＮ　０４９６—３４９０；ＣＯＤＥＮ　ＴＳＨＰＡ９　Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｂｚｗ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａ１．ｎｅｔ．ｃｎ　ＤｏＩ：ｌ０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１００６．２００８．０１５１０　马铃薯非特异性脂质转移蛋　白基因ＳｔＬＴＰａｌ的　克隆和表达　郜　刚１，２　任彩虹　金黎平　谢开云　屈冬玉　１，　（　中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京１０００８１；　山西师范大学生命科学学院，山西ｌ临汾０４１００４）　摘　要：非特异性脂质转移蛋白（ｎｓＬＴＰ）是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白，具有多种生物学功能，如抗菌防　御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶抑制等。通过接种青枯菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ），从马铃薯栽培品种中薯３号中　获得一个新的非特异性脂质转移蛋白ｃＤＮＡ克隆ＳｔＬＴＰａｌ，序列分析表明该基因含６３６　ｂｐ核苷酸，编码９１个氨基酸，　属于Ｉ类非特异性脂质转移蛋白。基于氨基酸序列构建的系统发生树揭示，该基因与其他茄科ｎｓＬＴＰ具有高度保守　的序列相似性，核酸和氨基酸水平分别具７５％　８５％和６０％～９２％的同源性。对该基因在互作早期基因表达时空性分　析表明，ＳｔＬＴＰａ１基因不仅受病菌的诱导，在不同抗、感病的马铃薯基因型中差异表达，而且受一定浓度外源非生物　激发子如水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应，其诱导表达模式也表现出一定的差异。原位　杂交结果显示ＳｔＬＴＰａ１主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。这些结果说明ＳｔＬＴＰａ１基因受病菌和　非生物激发子诱导，在植物防御反应中发挥作用。　关键词：马铃薯；非特异性脂质转移蛋白；ＳｔＬＴＰａｌ；克隆；表达　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｎｏｎ－Ｓｐｅｃｉｉｃ　Ｌｉｆｐｉｄ　Ｔｒａｎｓ－　ｆｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｔａｔｏ　ＧＡＯ　Ｇａｎｇ　＇　，ＲＥＮ　Ｃａｉ．Ｈｏｎｇ　，ＪＩＮ　Ｌｉ．Ｐｉｎｇ　，ＸＩＥ　Ｋａｉ．Ｙｕｎ　，ａｎｄ　ＱＵ　Ｄｏｎｇ．Ｙｕ　’　（　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ　ａｎｄＦｌｏｗｅｒｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８１；　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＬｉｆｅ　ｓｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｘｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒ－　ｓｉｔｙ，Ｌｉｎｆｅｎ　０４１００４，Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｌａｎｔ　ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｎｓＬＴＰｓ）ａｒｅ　ａｂｕｎｄａｎｔｌｉｐｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｔｈａｔ　ｐｌａｙ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｌ　ｄｅｆｅｎｓｅ，ｓｉｇｎａｌａｉｎｇ，ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ，ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ａｎｄ　ＳＯ　ｏｎ．Ａ　ｎｅｗ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ，ｎａｍｅｄ　ＳｔＬＴＰａｌ，ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｐｏｔａｔｏ　ｎｓＬＴＰ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｃｕｌｉｔｖａｔｅｄ　ｐｏｔａｔｏ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ．Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｃＤＮＡ　ｃｏｎｔｍｎｅｄ　６３６　ｂｐ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ａ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｎｓＬＴＰ　ｏｆ　９　１　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｔｈｅ　ＳｔＬＴＰａｌ　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ｗｅｌｌ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｗｉｔｈ　６０－９２％ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ａｔ　ｈｅ　ｔａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｌｅｖｅｌ，ａｎｄ　７５—８５％ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ａｔ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｌｅｖｅｌ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　Ｓｏｌｎａｃｅａｅ　ｎｓＬＴＰｓ．Ｔｈｅ　ｔａｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｏｆ　ｈｅ　ｇｅｎｅ　ｔａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｐｏｔａｔｏ　ｌｅａｆ　ｎｄ　ｓｔｅｍ　ｔａｉｓｓｕｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ尼ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　ｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｄｏｍｉａｎａｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｎｄ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｈｅ　ｔＳｔＬＴＰａｌ　ｍＲＮＡ　ｗａｓ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｐｈｌｏｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌｒ　ａｔｉｓｓｕｅｓ　ｉｎ　ｐｏｔａｔｏ　ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｓｔｅｍ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ，ｍｅｔｈｙｌ　ｊａｓｍｏｎａｔｅ　ｎｄ　ａａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ＳｔＬＴＰａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｔｈｒｅｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ａ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＳｔＬＴＰａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ－－Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｔｈｕｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＳｔＬＴＰａｌ　ｍａｙ　ｂｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｐｌｎｔ　ａｄｅｆｅｎｓｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｖｏｌｖｅ　ｉｎ　ａ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｎｅｔｗｏｒｋ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ；Ｎｏｎ—・ｓｐｅｃｉｉｃ　ｌｆｉｐｉｄ—・ｒａｔｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳｔＬＴＰａｌ；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　植物非特异性脂质转移蛋白（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｌｉｐｉｄ—　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｎｓＬＴＰ）是在植物界中分布极广的一　种植物［１－３１。该蛋白由多基因家族编码，具有多种异　构体　钔，富含半胱氨酸，通常根据其初级结构可以　分为３类　，据最新报道认为，通过全基因组解析水　类小分子脂质结合蛋白，至今已发现其存在于５０多　基金项目：国家高技术研究发展计￣（８６３计划）项目（２００３ＡＡ２０７１３０）；Ｉ』１西省自然科学基金项目（２００５１０４２）　作者简介：郜刚（１９７１－），男，山西临汾人，博士研究生，副教授，研究方向：马铃薯分子生物学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｇｇｎｉｃｈｅ＠１２６．ｃｏｍ　通讯作ｉ￣（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ）：屈冬玉，研究员，研究方向：马铃薯遗传育种。Ｔｅｌ：ＯＩＯ一８２１０９５４３；Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｙｑｕ＠ｍａｉｌ．ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃａ　Ｒｅｃｅｉｖｅｄ（收稿日期）：２００８—０３—２０；Ａｃｃｅｐｔｅｄ（接受日期）：２００８—０４一Ｏ１．　维普资讯 http://www.cqvip.com 第９期　郜　刚等：马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因ＳｔＬＴＰａ１的克隆和表达　稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）和拟南芥　ｃａｗｒｉａ）抗病过程中发挥作用的，同时还受到其他非　生物和环境因素的诱导【１２－１５］。由此可见，茄科非特　异性脂质转移蛋白可能同样具有多种生物学功能。　在马铃薯中关于非特异性脂质转移蛋白生物学功能　的报道仅限于块茎发育，迄今为止还没有关于　ｎｓＬＴＰ与马铃薯青枯病（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）相　ｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）的ｎｓＬＴＰ，可以进一步分为９　个不同的进化分支。Ｉ类（ｎｓＬＴＰ１）和ＩＩ类（ｎｓＬＴＰ２）　分子量分别约为９　ｋＤ和７　ｋＤ，碱性，ｐ，介于８．８～１０．０　之间　，ＩＩＩ类（ｎｓＬＴＰ３）是花粉特异表达蛋白，分子　量等化学特性与ＩＩ类相似ｌ６］。非特异性脂质转移蛋　白与特异性脂质转移蛋白的主要区别在于其转移的　脂类不具特异性【１　引。Ｉ类ｎｓＬＴＰ通常为球状小分子，　关的报道。因此，分离、鉴定马铃薯与青枯菌互作　过程中被诱导的ｎｓＬＴＰ基因，并对其生物学功能和　含有４个０【螺旋，由４个二硫键联系在一起并形成　一个疏水腔，可以结合脂肪酸、酰基或磷脂等分子【９】，　其显著特征在于这个疏水腔横贯球体且具有柔韧性，　可以调节容积大小以结合或容纳多种类型的脂类分　子陷。刚。体外实验证明其具有膜间转脂的作用，但在　体内尚未找到相关证据…，如小麦ｎｓＬＴＰ与磷脂类　的互作表明在正常生理情况下它并不能从膜上荷载　脂分子口”。随着新的ｎｓＬＴＰ的不断发现，其功能显　得更加复杂和多样化【４】。因此，具体了解各类非特异　性脂质转移蛋白的结构与生物学功能显得十分必　要。　尽管尚未发现某种植物的ｎｓＬＴＰ可以在体内进　行脂质转移，但有不少间接证据为解释植物非特异　性脂质转移蛋白的生物学功能提供了线索。首先，　一些研究表明ｎｓＬＴＰ参与植物防御机制，对细菌、　真菌甚至病毒具有抗性　Ｊ，而且ｎｓＬＴＰ的表达调控　呈现一定的多样性，许多信号分子如乙烯、水杨酸、　茉莉酸（甲酯）、脱落酸和各种环境因子如干旱、高温　胁迫都能够影响其表达¨１－１５］。有报道指出，在拟南　芥中，ｎｓＬＴＰ参与系统获得抗　１￣（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＳＡＲ）相关的长距离信号传导ｌ】引。具有这　种抗病功能的常见于Ｉ和ＩＩ类。其次，ｎｓＬＴＰ在某些　植物食品和花粉中是一种过敏原，能够引起易感者　过敏Ｉ　引，如ＩＩＩ类ｎｓＬＴＰ。另外少数ｎｓＬＴＰ如在银杏　（Ｇｉｎｋｇｏ　ｂｉｌｏｂａ）等，具有蛋白酶抑制子的功能【】　。在　茄科中，关于非特异性脂质转移蛋白的研究较少，　已发现两个马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｎｓＬＴＰ　ｃＤＮＡ　片段在块茎发育过程中是上调表达的，并且与打破　块茎休眠和发芽相关，主要积累于块茎发育相关组　织的韧皮部Ｉ１７］。番茄野生种Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ　中分离的３个ｎｓＬＴＰ（　Ｌｔｐ　，２，３）对干旱胁迫表现　一定的反应，而且受脱落酸的诱导，但是这３个成　员在果实中的表达模式迥异【】引。在辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ）中分离的３个ｎｓＬＴＰ（ＣＡＬＴＰＩ，ＩＩ，ＩＩＩ）被认为　是在辣椒疮痂病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．ｖｅｓｉ．　作用机制进行研究，对于揭示植病互作机制、寻找　马铃薯抗病新基因等非常重要。　本研究利用构建病菌诱导的ｃＤＮＡ　ＳＳＨ文库，　结合ＲＡＣＥ技术克隆了一个新的马铃薯ｎｓＬＴＰ基因　的全长ｃＤＮＡ，并对其序列结构、进化特征和诱导表　达模式进行了研究。　１材料与方法　１．１植物材料和青枯菌株　马铃薯青枯病抗、感病基因型材料分别为　ＭＳ４２．３和中薯３号，青枯菌菌株ＰＯ４１（生理小种３　号，生化变种２号）均由蔬菜花卉研究所提供。种薯　播种于温室，幼苗移栽于１０　ｃｍ含草炭，蛭石（３：１）　营养钵中，３～４周长至９～１０叶期。参照何礼远等【１９　方法接种。　１．２化学处理　取健康９～１０叶期幼苗做如下化学处理。水杨酸　（ＳＡ）溶于水至５　ｍｍｏｌ　Ｌ～，茉莉酸甲酯（ＭＪ）初溶于　１００％乙醇，以水定容至５０　ｐ．ｍｏｌ　Ｌ～，其中加Ｔｗｅｅｎ　２０（０．０１％），喷于茎叶至形成微滴，对照以Ｔｗｅｅｎ　２０１水代替，迅速密封于合适的黑色塑料袋中，室温　处理２４　ｈ，之后重复一次【　】。脱落酸（ＡＢＡ）初溶于　１００％乙醇，以水定容至５０￣ｔｍｏｌ　Ｌ～，对照代以　０．１％（　乙醇【２刚。处理后不同时间点对茎叶取样，　速冻于液氮用于ＲＮＡ制备。　１．３　ＲＮＡ／ＤＮＡ韦０备　采用ＴＲＩｚｏｌ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）提取总ＲＮＡ，　使用Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　ＳＭＡＲＴ　ＰＣＲ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ），按其说明进行反转录。ＤＮＡ提取　采用ＣＴＡＢ法，裂解液成分为１０％（ｗ／ｗ）ＰＶＰ，２％　（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ，７５　ｍｍｏｌ　Ｌ～Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ（ｐＨ　８．０），１５　ｍｍｏｌ　Ｌ一　ＥＤＴＡ（ｐＨ　８．０），１．０５　ｍｏｌ　Ｌ～ＮａＣＩ，４％　（ｖ／ｖ）Ｂ．巯基乙醇。　１．４抑制消减杂交和序列分析　使用ＰＣＲ—Ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ　Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）　维普资讯 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作物学报　第３４卷　构建消减ｃＤＮＡ文库，以接种病菌为测试方（ｔｅｓｔｅｒ），　对照为驱动方（ｄｒｉｖｅｒ），消减产物克隆于ｐＧＥＭ—Ｔ并　转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。利用ＰＣＲ—　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）筛选出３８４　ｃＤＮＡ阳性克隆。由上海生工生物技术公司测定序　列，利用ＧｅｎＢａｎｋ的Ｂｌａｓｔ程序比对核酸数据，以　Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ线性比对氨基酸序列，用ＭＥＧＡ软件ｌ　］　绘制系统进化树。　１．５分离全长ｎｓＬＴＰ　ｃＤＮＡ　因获得的相关ＥＳＴ含有３　ＵＴＲ，故利用５　一ＲＡ　ＣＥ法分离其全长，采用ＳＭＡＲＴ—ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌ—ｉｉｆｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），设计５　基因特异引物　ＧＳＰ１：５　一ＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＧＧＡＣＣＧＣ一３　和ＧＳＰ２：５　ＧＧＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＡ　ＴＧＴＡＡ一３　配合通用引物ＵＰＭ克隆全长，命名为　ＳｔＬＴＰａｌ，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＥＵ０５７７１６。　１．６　Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ、ＲＴ．ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交　参照Ｊａｉｎ等ｌ　１方法进行Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ，利用　Ｂｉｏ—Ｒａｄ　ｉＣｙｃｌｅｒ　ｉＱ检测系统进行反应并分析。根据　Ｗａｗｒｚｙｎｓｋａ等　方法进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ—　ＰＣＲ。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ正向引物为５　一ＴＧＧＣＴＣＣＣＴＧ　ＣＣＴＣＣＣＴＩ＇ＡＴＣ　３　，反向引物５　一ＣＣＡＴＣ１］　ｒｒＣＴＴ　ＣＡＴＣＴＣＣＧ．．３，内参Ａｃｔｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｘ５５７４７）　引物分另Ｕ为５　一ＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡ一３　，５　一　ＧＧＡＴＴｃｃＡＧｃＴＧｃＴＴｃｃＡＴＴｃ．３　。根据Ｐｆａｆｉｆ等ｌ　］　方法进行反应特异性和相对表达量计算。ＲＴ—ＰＣＲ　引物为５　一ＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣ丌ＡＴＣＴＴ－３　，５　一ＣＴＴ　ＴＴＣＣＣＧＴＡＴＣＡＡＴＧＣＣＣＴ－３　。实验重复３次。　１．７　组织原位杂交　根据Ｅｌｏｒｚａ等ｌ　利用地高辛标记的ＲＮＡ探针　与马铃薯茎叶石蜡组织切片进行原位杂交。ＳｔＬＴＰａｌ　基因特异ＰＣＲ产物用于合成探针，正义和反义探针　利用ＤＩＧ　ＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（ＳＰ６／Ｔ７；Ｒｏｃｈｅ）标记地高　辛一ＵＴＰ，引物分别为５　一ｃＡＴｃＴＴＡＴＴｃＴＴｃＡＴｃＴｃ　ＣＧＣ一３　和５　一ＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＡＴＣ一３　２结果与分析　２．１克隆和鉴定ＳｔＬＴＰａｌ基因　通过构建病原诱导马铃薯茎特异的消减ｃＤＮＡ　文库，利用５　一ＲＡＣＥ　ＰＣＲ从获得的相关克隆中扩增　出编码ｎｓＬＴＰ的全长ｃＤＮＡ，长６３６　ｂｐ，命名为　ＳｔＬＴＰａｌ，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＥＵ０５７７１６。序列分析发现　其结构与其他物种如拟南芥、水稻等Ｉ类非特异性　脂质转移蛋白类似，等电点较接近，约为９．４０。经推　导，该基因编码１ｌ４个氨基酸，同时具有保守的信　号肽序列和半胱氨酸［２６－２７］，切除信号肽后的成熟蛋　白质具９１个氨基酸（图１）。经Ｃｌａｓｔａｌ　Ｗ比对，发现　该基因与其他茄科ｎｓＬＴＰ具有高度保守的序列特征，　核酸和氨基酸水平分别具７５％～８５％和６０％～９２％的　同源性。　ＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＡＴＣＧＡＴＣＴＴＴＡＣＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧ　６０　Ｍ　Ｅ　Ｍ　Ｆ　－２０　ＧＣＡＡＡＡＴＴＧｃＡＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＡＣＣＣｃＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣ　１　２Ｏ　Ｇ　工　冉　Ｃ　Ｆ　Ｖ　工　工　Ｃ　Ｍ　Ｖ　Ｖ　Ｖ　Ａ　Ｐ　Ｒ　Ａ　Ｅ　Ａ　ｌ　ＴＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧｃＧ　ｌ　８Ｏ　Ｌ　Ｓ　Ｃ　Ｇ　Ｅ　Ｖ　Ｔ　Ｓ　Ｇ　Ｌ　Ａ　Ｐ　Ｃ　Ｌ　Ｐ　Ｙ　Ｌ　Ｑ　Ｇ　Ｒ　２Ｉ　ＧＴＣＣＴＡＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴｃＴＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＣＣＣＡＧ　２４０　Ｇ　Ｐ　Ｉ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｇ　Ｇ　Ｖ　Ｋ　Ｇ　Ｌ　Ｌ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｋ　Ｔ　Ｐ　４ｌ　ＡＡＧＡＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＡＧＧＧＣＡＴＴＧ　３００　Ｅ　Ｄ　Ｒ　Ｋ　Ｔ　Ａ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｌ　Ｋ　Ｓ　Ａ　Ａ　Ｎ　Ｓ　Ｉ　Ｋ　Ｇ　Ｉ　６ｌ　ＡＴＡＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＡＡＧＡＴＣＡ　３６０　Ｄ　Ｔ　Ｇ　Ｋ　Ａ　Ｖ　Ｇ　Ｌ　Ｐ　Ｇ　Ｖ　Ｃ　Ｇ　Ｖ　Ｓ　Ｉ　Ｐ　Ｙ　Ｋ　Ｉ　８ｌ　ＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧＡＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＧＴｃＣＡＧＴＡＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＡＡＧＴＣＴＡＴＡ　４２０　Ｓ　Ｐ　Ｓ　Ｔ　Ｄ　Ｃ　Ｓ　Ｋ　Ｖ　Ｑ　９ｌ　ＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＡＴＡＴＣＧＡＴＣＧＡＧＴＴＴＧＡＴｃＣＡＴＣＡＴＴ　４８０　ＡＴＡＴ＾ＴＧＴＴＧＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧ＾ＧＴＡＣＴＴＡＴＡＴＡＴＴＧＴＣＧＡＧ　５４０　ＴＣＴＴＧＴＡＡＴＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＴＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＡＴ　６００　ＧＡＴＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　６３６　图１　ＳｔＬＴＰａｌ的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列　Ｆｉｇ．１　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｆｏｒ　ＳｔＬＴＰａｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　氨基酸序号自成熟蛋白质Ｎ端的丙氨酸编起；斜体部分为信号　肽；两线部分为钙调素结合位点。　Ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｒｅ　ｎｕｍｂｅｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ａｌａｎｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｆｏｕｎｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｔｈｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｒｅ　ｉｔａｌｉｃ；ｔｈｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＣａＭ．ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ　ｉｓ　ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．　采用邻接法构建了茄科４８个ｎｓＬＴＰ的无根系统　发生树（图２），从系统发生树上节点位置和分支长度　的量化数值上分析，尽管存在小的不同的亚类，但　大的分类上可以将茄科现有的ｎｓＬＴＰ分为Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ　类，这３类大致符合ｎｓＬＴＰ１、２、３的分子特　。其　中Ｉ类群包纳的ｎｓＬＴＰ最多，涉圾的种较多，几乎都　是ｎｓＬＴＰ１；ＩＩ类群最少，全是烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｇｌａｕｃａ）　ｎｓＬＴＰ１：第１ＩＩ类群主要包括了ｎｓＬＴＰ２类转脂蛋白，　与其他ｎｓＬＴＰ１明显具有较长的系统发生距离。从图　中可以看出马铃薯ＳｔＬＴＰａｌ基因与番茄（　．１ｙｃｏｐｅｒ．　ｓｉｃｕｍ）的一个ｎｓＬＴＰ１同属一支，显示它们可能具有　共同的起源。唯一有出入的马铃薯ＢＡＣ２３０５２　ｎｓＬＴＰ　因其本身序列明显短于其他成员而归属于第１ＩＩ类，　怀疑是分歧所致的。另外ＳｔＬＴＰａ１基因编码的产物　虽然与马铃薯其他成员同归于Ｉ类，但分属于两个　不同的亚群，这暗示在马铃薯基因组中存在其他新　成员的可能性。　维普资讯 http://www.cqvip.com 第９期　郜　刚等：马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因ＳｔＬＴＰａｌ的克隆和表达　图２基于成熟氨基酸序列的茄科ｎｓＬＴＰ的系统发生树　Ｆｉｇ．２　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ　ｎｓＬＴＰｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｔｕｒｅ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　以４８个单一氨基酸序列作分析；各蛋白的原始序列接受号列于种名之后；底部标尺表每个位点发生０．１次氨基酸替代的进化距离；　系统发生树使用ＭＥＧＡ软件采取邻接法构建。　Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　４８　ｕｎｉｑｕｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｍｐｉｌｅ　ｔｈｅ　ｔｒｅｅ　ａｒｅ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｎａｍｅ．Ｔｈｅ　ｓｃａｌｅ　ｂａｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ　ｔｏ　ａｎ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　０．１　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ（ａａ）ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｐｅｒ　ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｔｒｅｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎｅｉｇｈｂｏｒ—Ｊｏｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｄｒａｗｎ　ｂｙ山ｅ　ＭＥＧＡ　ｐｒｏｇｒａｍ．　２．２青枯菌诱导ＳｔＬＴＰａｌ基因在不同抗、感病基　因型中的表达模式　为探讨ＳｔＬＴＰａｌ基因在马铃薯与青枯菌互作早　特征进行了系统分析（图４），ＳｔＬＴＰａｌ基因不仅在抗、　感病基因型中具有病菌诱导表达的差异性（图４一Ａ对　Ｂ、Ｃ对Ｄ），而且在同一类型马铃薯的不同部位也存　在较明显的差异（图４一Ａ对Ｃ、Ｂ对Ｄ），表现出一定　期表达的时间和空间特性，采用两步分析法对接种　后的马铃薯茎叶组织ＲＮＡ转录本丰度随着早期病　程发展的变化进行了比较。首先，对接种后总ＲＮＡ　的系统诱导性。病菌在抗病基因型中能够诱导　ＳｔＬＴＰａｌ基因既快速且持久地表达，相对靠近接种　在不同时问点进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析（图３），结果显　示接种后３～５　ｄ　ＳｔＬＴＰａｌ转录本在抗病基因型和感　点的下部茎叶组织表达量较弱，远离接种点的上部　茎叶组织中表达量较强；而在感病基因型中这种诱　病基因型中都表现上调，抗病基因型中诱导的速率　和强度较高于感病基因型，表明该基因不仅受病原　的诱导，而且受寄主故有抗性的影响。第二步用　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ对该基因在不同组织位置之间的表达　导是短暂的，在接种后３　ｄ时达到最高峰，随后有所　减弱，与抗病基因型另一个不同点在于下部茎叶组　织的诱导强于上部组织，似乎反映出病菌在感病基　因型中能够较快克服该基因产物的作用。这一点与　维普资讯 http://www.cqvip.com

Ｓ　ａ　作物学报　第３４卷　儿　Ｔ　ｍ　ｎ　病原菌在寄主体内的居群动态相吻合（图３－Ｅ、Ｆ）。　兰！　！　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　０　ｄｐｉ　１　ｄｐｉ　３　ｄｐｉ　５　ｄｐｉ　０　ｄｐｉ　１　ｄｐｉ　３　ｄｐｉ　５　ｄｐｉ　图３　ＳｔＬＴＰａｌ基因表达的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析　Ｆｉｇ．３　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＳｔＬＴＰａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　２．３　ＳｔＬＴＰａｌ基因表达受非生物激发子的影响　如图５所示，水杨酸、茉莉酸和脱落酸都能够　不同程度地诱导ＳｔＬＴＰａｌ基因上调表达，从处理后１　ｄ起，至３　ｄ或５　ｄ达到高峰，这种上调持续的时间　较长，尤其是在抗病基因型中。在感病基因中，茉莉　酸和水杨酸诱导的ＳｔＬＴＰａｌ转录本在表达高峰后都　一定程度地下降，相对于脱落酸的作用而言，相对　表达量较弱。在抗病基因型中，这种效果尤其明显，　这表明脱落酸可能对ＳｔＬＴＰａｌ的诱导存在不同于水　杨酸或者茉莉酸的机制，这种机制使ＳｔＬＴＰａｌ基因　的上调表达更快捷，以至于使其转录本在接种后１　ｄ　的丰度就高于其他两种激发子的作用。显示脱落酸　对该基因的调控更加有效。　２．４　ＳｔＬＴＰａｌ基因表达的组织定位　利用原位杂交对ＳｔＬＴＰａｌ基因表达进行组织定位　结果（图６）显示，在接种后３　ｄ取材的杂交中，ＳｔＬＴＰａｌ　ｍＲＮＡ主要分布在茎微管系统的韧皮部和叶片维管　束，在茎的表皮细胞有极微弱的杂交信号。作为对　照的未接种健康植株未见杂交信号。对根组织的原　位杂交中，无论接种与否均未检测到有该基因的表　达。说明病菌诱导的ＳｔＬＴＰａｌ基因表达位点主要在　茎叶组织的韧皮部而非木质部。　３　讨论　３．１　ＳｔＬＴＰａｌ基因结构与进化　本研究从马铃薯中克隆了一个新的ｎｓＬＴＰ１基　因，对其结构特征、表达性质和组织定位等的分析　为此类蛋白生物学功能的确定提供线索。ＳｔＬＴＰａｌ　具有Ｉ类ｎｓＬＴＰ所共有的结构特征如低分子量、保　守的半胱氨酸残基、碱性等电点、以及位于Ｃ一末端　的钙调素结合位点【１引，而且序列整体具高度相似性；　ＳｔＬＴＰａ１在系统进化树上与Ｊｕｎｇ等　，　。　报道的受病　菌诱导的辣椒ｎｓＬＴＰ同处一个亚群，暗示其可能参　与青枯病防御反应，这一点在病菌诱导表达分析中　得到了证实。这与以往发现的其他植物脂质转移蛋　白参与抗病反应的结果是一致的［２７，２９－３５１。对ＳｔＬＴＰａｌ　基因编码的氨基酸序列进行保守区及功能位点和系　统发生分析表明它是马铃薯非特异性脂质转移蛋白　家族的一个新成员，在进化上与番茄（Ｓ．１ｙｃｏｐｅｒｓｉ。　ｃｕｍ）的ｎｓＬＴＰ（Ｐ９３２２４）具共同的祖先。　３．２青枯菌诱导ＳｔＬＴＰａｌ基因在不同抗、感病基　因型中的表达模式　非特异性脂质转移蛋白参与植物防御反应的分　子机制目前并不清楚，研究者一般通过分离纯化蛋　白质、体外检测其活性ｌｌⅢ，或者在植物体内分析其　对病原物反应的基因表达模式来确定其活性［２８，３０］。　某些ｎｓＬＴＰ１被认为是与角质素和木栓层的形成相　关联的，可以抑制真菌等的生长。从辣椒（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｕｕｍ）中分离的一个ＬＴＰ在拟南芥中的异源表达能　够增加其对灰霉病抗性ｌｌ　。本研究关于ＳｔＬＴＰａｌ在　不同抗病材料中存在差异表达的实验结果说明　ＳｔＬＴＰａｌ的表达参与了寄主植物的抗性反应，在病　理学上表现为可以在一定程度上抑制青枯菌在马铃　薯体内的居群扩张，与病菌在微管系统的居群动态　有一定的关联。在以往的实验结果中尚未见类似报　道。　马铃薯青枯病属于维管束系统病害ｌｌ引，维管束　系统由韧皮部和木质部构成，在植物体内形成连续　的运输系统，负责运输水分、营养和信号分子。在　马铃薯青枯病中，这种特殊的结构系统却成了病原　菌入侵、定殖和扩张的场所。ＳｔＬＰＴａｌ基因在微管　系统的诱导性表达模式提供了这样一种可能性，即　其表达可能诱导了某种特殊信号，进而导致对病菌　入侵和扩张的连续反应。虽然目前尚未确定这种诱　导信号分子，但是ＳｔＬＰＴａｌ在下部感染位点（１ｏｗｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）和上部系统位点（ｕｐｐｅｒ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｓｉｔｅ）的　差异表达暗示存在某种可以长距离传输的信号。　Ｍａｌｄｏｎａｄｏ等［１６１发现在拟南芥脂质转移蛋白ＤＩＲ１　在病菌入侵的情况下可以与一种脂源分子（１ｉｐｉｄ—　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）互作并促进长距离信号传导。这种　脂源分子可能是由病菌的质膜上合成或者释放的羟　脂如茉莉酸、磷脂酸或者Ｎ一酰基乙醇胺，在植物防　御信号中能够起到次级信使的作用。植物非特异性　脂质转移蛋白的空间结构表明其内部的疏水性腔足　以容纳脂肪酸或者磷脂分子，而其氨基端的信号　维普资讯 http://www.cqvip.com 第９期　郜　刚等：马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因ＳｔＬＴＰａｌ的克隆和表达　１５１５　Ａ　Ｂ　ｕＮ　ｃ０Ｉ】曼：口０口高ＩＪｕ　０对　＞ｕ—ｃ０　∞　口　ｕ　ｕ＾ｌ　＞ｕ—ｃ０　∞　ｕ　ｕ三　一ｕ　Ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｃ　ｕ　ｃ０一　ｊ　０口　￡ｕｌ。对∞　＞ｕ—ｃ０　∞　口　ｕ　ｕ＾Ｉ　Ｄ　＞ｕ—ｃ０　∞　口×ｕ　ｕ之　Ｆ　６　一ｕ暑∞　基ｕ１ｓ　０　ｆ１　ｕ　０一一　５　４　３　２　１　０　Ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｏｃｕｌ￣ｉｏｎ　Ｅ　６　Ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　５　—兰　４　ｇ　０　∞　０　Ｊ　ｒ＝　Ｏ　３　Ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｄａｙｓ　ｐｏｓｔ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　５　图４　马铃薯与青枯菌互作早期，ＳｔＬＴＰａｌ基因在不同抗感病基因型中的差异表达　Ｆｉｇ．４　Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＳｔＬＴＰａｌ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｐｏｔａｔｏ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ　ｏｆＲ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ－ｐｏｔａｔｏ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　Ａ和Ｂ：不同时间点ＳｔＬＴＰａｌ基因在感病（Ａ）、抗病（Ｂ）基因型上部茎叶组织（６～７节）之间的差异表达的ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测，Ａｃｔｉｎ为内　参，将其丰度平均值设为１，相对表达丰度均与内参比较使其标准化，统计学显著性为３次重复的ｆ一检验，Ｐ＜０．Ｏｌ，误差线表示平均值±标　准误；Ｃ和Ｄ：不同时间点ＳｔＬＴＰａｌ基因在感病（ｃ）、抗病（Ｄ）基因型下部茎叶组织（第２～４节）之间的差异表达；Ｅ和Ｆ：青枯菌（生理小　种３号，生化变种２号，菌株ＰＯ４１）在感病（Ｅ）、抗病（Ｆ）基因型茎维管组织中的居群动态。重复３次，每次３株。　Ａ　ａｎｄ　Ｂ：Ｔｉｍｅ　ｃｏｕｒｓｅｓ　ｏｆ　见　口』ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｐｐｅｒ（ｂｅｔｗｅｅｎ　６ｔｈ一７ｔｈ　ｎｏｄｅｓ）ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ（Ａ）ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（Ｂ）ｇｅｎｏ—　ｔｙｐｅｓ　ａｔ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｔｉｍｅ　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｖａｌｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｔｏ　ａｃｔｉｎ　ａｔ　ｅａｃｈ　ｔｉｍｅ—ｐｏｉｎｔ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉ—　ｃａｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｈ　Ｓｔｕｄｅｎｔｔｓ　ｔ－ｔｅｓｔ：Ｐ＜０．Ｏ１．Ｅｒｒｏｒ　ｂａｒｓ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｈｅ　ｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ　ｅｒｒｏｒ．Ａｓ　ａ　ｃｏｎｔｒｏ１．　ｈｅａｌｔｈｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｍｏｃｋ—ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｗａｔｅｒ．Ｃ　ａｎｄ　Ｄ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＳｔＬＴＰａ１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｒ　ｆｂｅｔｗｅｅｎ　２ｎｄ一４ｔｈ　ｎｏｄｅｓ）　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ（Ｃ）ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（Ｄ）ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ａｔ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｔｉｍｅ　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｅ　ａｎｄ　Ｆ：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｓｉｚｅｓ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＰＯ４１　ｉｎ　ｐｏｔａｔｏ　ｏｆ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ（Ｅ）ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（Ｆ）ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｏｖｅｒｇｒｏｕｎｄ　ｓｔｅｍ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓａｍｐｌｅｄ　ｂｙ　ｇｒｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｆｆｌｕｅｎｔ　ｗａｔｅｒ　ｗａｓ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ—ｐｌａｔｅｄ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ．Ｗｉｈ　Ｓｔｔｕｄｅｎｔ’Ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ，ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ａｔ　Ｐ＜０．０５　ａｎｄ　３　ｐｌａｎｔｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｆｏｒ　ｅａｃｈ．　肽可以将成熟蛋白定位至细胞壁¨引，因此这些特性　为ｎｓＬＴＰ发挥这种参与长距离信号传导的功能提供　３．３　ＳｔＬＴＰａｌ基因的表达受非生物因子的影响　最近一些报道显示植物的ｎｓＬＴＰ表达通常与防　了可能性。本研究中ＳｔＬＰＴａｌ的茎叶组织特异性和　系统诱导表达似乎也支持了这一点。综上所述，　ＳｔＬＴＰａｌ基因的组织原位杂交和时空表达模式显示　御信号分子相关联［１，１２－１３１。ＶｖＬＴＰ４与茉莉酸形成的　复合体在体外试验中能够诱导葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）对　灰霉病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）的高水平耐性…。烟草　了该基因在维管束系统中发挥其生物学功能。　ＮｔＬＴＰ１可以结合茉莉酸形成复合体并与一种质膜　维普资讯 http://www.cqvip.com

ｌ５ｌ６　作物学报　第３４卷　Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ＡＢＡ　ＳＡ　ＭＪ　Ｍｏｃｋ　Ａｃｔｉｎ　图５　化学处理后ＳｔＬＴＰａｌ基因在马铃薯茎中的　表达的ＲＴ－ＰＣＲ检测　Ｆｉｇ．５　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳｔＬ　ｊ　ｉｎ　ｐｏｔａｔｏ　ｓｔｅｍｓ　ａｔ　ｖａｒｉＯＵＳ　ｔｉｍｅ　ｉｎｔｅｒｖａｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　Ｍｏｃｋ：模拟处理作为对照；Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ：抗病基因型；Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ：　感病基因型：图示为一次代表性试验结果，使用的激素为ＡＢＡ　（５０￣ｔｍｏ！Ｌ　）、ＳＡ（５　ｍｍｏ｜Ｌ　）、ＭＪ（５０￣ｔｍｏｌ　Ｌ　）。　Ｍｏｃｋ：Ｈｅａｌｔｈｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｍｏｃｋ—ｔｒｅａｔｅｄ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ：ｒｅｓｉｓｔａｎｔ：ｒｅ—　ｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ；ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｆｉｇｕｒｅ　４　ａｒｅ　ｆｒｏｍ　ａ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＳＡ（５　ｍｍｏｌ　Ｌ　），ＭＪ（５０　ｕｍｏｌ　Ｌ叫），ａｎｄ　ＡＢＡ（５０　ｍｏｌ　Ｌ＿。）．　图６　ＳｔＬＴＰａ１基因在马铃薯茎叶组织表达的原位杂交　Ｆｉｇ．６　Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳｔＬＴＰａｌ　ｍＲＮＡｓ　ｉｎ　ｐｏｔａｔｏ　ｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｌｅａｆ　ｔｉｓｓｕｅｓ　Ａ：叶组织横向切片用于正义ＳｔＬＴＰａｌ　ＲＮＡ探针的杂交；Ｂ：茎　组织横向切片用于正义ＳｔＬＴＰａｌ　ＲＮＡ探针的杂交；Ｃ：叶组织横　向切片用于反义ＳｔＬＴＰａｌ　ＲＮＡ探针的杂交；Ｄ：茎组织横向切片　用于反义ＳｔＬＴＰａ１　ＲＮＡ探针的杂交。箭头所示为杂交信号。ＵＥ：　上表皮：ＬＥ：下表皮；ｏｐ：外韧皮部；ｉｐ：内韧皮部；Ｖｓ：维管束；　ｘ：木质部。标尺长度１０　ＬＬｍ。　Ａ：Ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ　１０　ｐ．ｍ　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｅ　ＳｔＬＴＰａｌ　ＲＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ．Ｂ：Ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ　１０　ｕｍ　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍｓ　ｗｅｒｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｅ　ＳｔＬＴＰａｌ　ＲＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ．Ｃ：Ｔｈｅ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＳｔＬＴＰａｌ　ＲＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ　１０　ｐ．ｍ　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌｅａｖｅｓ．Ｄ：Ｔｈｅ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＳｔＬＴＰａｌ　ＲＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ　１０　Ｕｍ　ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｔｅｍｓ．Ｔｈｅ　ａｒｒｏｗｈｅａｄｓ　ｐｏｉｎｔ　ｏｕｔ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａ１．ＵＥ：ｕｐｐｅｒ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ；ＬＥ：ｌｏｗｅｒ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ；ｏｐ：ｏｕｔｅｒ　ｐｈｌｏｅｍ；ｉｐ：　ｉｎｎｅｒ　ｐｈｌｏｅｍ；Ｖｓ：ｖａｓｃｕｌａｒ　ｂｕｎｄｌｅ；ｘ：ｘｙｌｅｍ．Ｂａｒｓ＝ｌ０　ｕｍ．　定位的受体分子（ｅｌｉｃｉｔｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）发生作用　。在其　他植物中，ｎｓＬＴＰ的表达还受乙烯、水杨酸、脱落酸　等非生物激发子的诱导　１１，２９］。本文ＳｔＬＰＴａｌ的表达　受到水杨酸、茉莉酸和脱落酸的影响，说明在与病　菌互作过程中ＳｔＬＰＴａｌ的表达处于一种较复杂的调　控网络中。有必要针对该基因表达的精细细胞定位　和信号调控做进一步的深入研究，这对于解释早期　马铃薯与青枯菌的互作机理乃至为今后青枯病的控　制提供新的目标具有理论意义。　４　结论　从马铃薯ｃＤＮＡ文库中克隆了非特异性脂质转　移蛋白基因ＳｔＬＰＴａ１，开放阅读框为６３６　ｂｐ，编码９１　个氨基酸残基的成熟蛋白，在结构上具有ｎｓＬＴＰ１的　共同特征，进化地位与其他茄科ｎｓＬＴＰ１高度类似；　ＳｔＬＰＴａｌ在马铃薯与青枯菌互作的早期受病菌的诱　导而上调表达，在不同抗、感病材料中有明显差异，　相对感病基因型而言，在抗病基因型中的诱导表达　更快、更高、更强；ＳｔＬＰＴａｌ基因表达具组织特异性，　主要位于茎叶组织维管系统的韧皮部，未见于根；　同一基因型的马铃薯上部组织和下部组织中的表达　略有差异；ＳｔＬＰＴａｌ基因表达受水杨酸、茉莉酸和脱　落酸的诱导。　致谢：本论文部分工作得到山西师范大学生命科学　学院２００４级硕士研究生张丽萍的帮助，在此表示感　谢。　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　［１］Ｙｅａｔｓ　Ｔ　Ｈ，Ｒｏｓｅ　Ｊ　Ｋ　Ｃ．Ｔｈｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｅｘ—　ｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｌａｎｔ　ｌｉｐｉｄ—ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＬＴＰｓ）．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ，２００８，　ｌ７：ｌ９ｌ—ｌ９８　［２］Ｊｏｓｅ—Ｅｓｔａｎｙｏｌ　Ｍ，Ｇｏｍｉｓ—Ｒｕｔｈ　Ｆ　Ｘ，Ｐｕｉｇｄｏｍｅｎｅｃｈ　Ｐ．Ｔｈｅ　ｅｉｇｈｔｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｍｏｔｉｆ，ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ｐｌｎａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，４２：３５５—３６５　［３］Ｋａｄｅｒ　Ｊ　Ｃ，Ｊｕｌｉｅｎｎｅ　Ｍ，Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ　Ｃ．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ—　ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｐｉｎａｃｈ—ｌｅａｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ　ｐｈｏｓｐｈｏｌ—　ｉｐｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｔｏ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ｏｒ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏ—　ｃｈｅｒｎ．１９８４．１３９：４１　ｌ　ｌ６　［４］Ｂｏｕｔｒｏｔ　Ｅ　Ｃｈａｎｔｒｅｔ　Ｎ，Ｇａｕｔｉｅｒ　Ｍ　Ｆ　Ｇｅｎｏｍｅ—ｗｉｄｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｒｃｅ　ａｎｄ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ｎｓＬｔｐ）　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｉｅｓ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｎｓＬｔｐ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ＥＳＴ　ｄａｔａ　ｍｉｎｉｎｇ．ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，９：８６　［５］Ｋａｄｅｒ　Ｊ　Ｃ．Ｌｉｐｉｄ—ｒｔｎａｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ　ｐｕｚｚｌｉｎｇ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．１９９７．２：６６—７０　［６】Ｌａｕｇａ　Ｂ，Ｈａｒｂｏｎｎｅｌ—Ｃａｍｐａａ　Ｌ，Ｃｏｍｂｅｓ　Ｄ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＺｍ３・ｉ　ａ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　ｔａｐｅｔｕｍ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，２０００，　ｌ５７：６５—７５　［７】Ｃｈａｅ　Ｋ，Ｚｈａｎｇ　Ｋ，Ｚｈａｎｇ　Ｌ，Ｍｏｒｉｋｉｓ　Ｄ，Ｋｉｍ　Ｓ　Ｔ，Ｍｏｌｌｅｔ　Ｊ　Ｃ，ｄｅ　ｌａ　Ｒｏｓａ　Ｎ，Ｔａｎ　Ｋ，Ｌｏｒｄ　Ｅ　Ｍ．Ｔｗｏ　ＳＣＡ（ｓｔｉｇｍａ／ｓｔｙｌｅ　ｃｙｓ—　维普资讯 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第９期　郜　刚等：马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因ＳｔＬＴＰａｌ的克隆和表达　１５１７　ｔｅｉｎｅ—ｒｉｃｈ　ａｄｈｅｓｉｎ）ｉｓｏｆｏｒｌｒｌＳ　ｓｈｏｗ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｔｈａｔ　ｃｏｒ－　ｒｅｌａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅｉｒ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐｏｌｌｅｎ　ｔｕｂｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００７，２８２：３３８４５—３３８５８　［８］Ｓａｌｃｅｄｏ　Ｇ，Ｓ￣ｎｃｈｅｚ—Ｍｏｎｇｅ　Ｒ，Ｂａｒｂｅｒ　Ｄ，Ｄｉａｚ・Ｐｅｒａｌｅｓ　Ａ．Ｐｌａｎｔ　ｎｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｎ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ａｌｌｅｒｇｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，２００７，１７７　ｌ：　７８ｌ—７９ｌ　［９］Ｓａｍｕｅｌ　Ｄ，Ｌｉｕ　Ｙ　Ｊ，Ｃｈｅｎｇ　Ｃ，Ｌｙｕ　Ｐ　Ｃ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｌｎａｔ　ｎｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ一２　ｆｒｏｍ　ｒｉｃｅ　ｆＯｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００２，２７７：３５２６７—３５２７３　［１０］Ｃａｒｖａｌｈｏ　Ａ　Ｏ，Ｇｏｍｅｓ　Ｖ　Ｍ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－－Ａ　ｃｏｎｃｉｓｅ　ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００７，２８：　ｌ　１４４－ｌｌ５３　［１１］Ｂｌｅｉｎ　Ｊ　Ｐ，Ｃｏｕｔｏｓ—Ｔｈｅｖｅｎｏｔ　Ｐ，Ｍａｒｉｏｎ　Ｄ，Ｐｏｎｃｈｅｔ　Ｍ．Ｆｒｏｍ　ｅｌｉｃ．　ｉｔｉｎｓ　ｔｏ　ｌｉｐｉｄ・－ｒｔａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ　ｎｅｗ　ｉｎｓｉｇｈｔ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ・－　ｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｎｃｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，２００２，７：　２９３－２９６　［１２］Ｊｕｎｇ　Ｈ　Ｗ，Ｌｉｍ　Ｃ　Ｗ，Ｈｗａｎｇ　Ｂ　Ｋ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｐｅｐｐｅｒ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＩＩ　ｔＣＡＬＴＰＩＩｌ１　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｏ　ｐａｔｈｏｇｅｎ，ａｂｉｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｒｔｅｓｓｅｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｆ，２００６，１７０：２５８￣５６　［１３］Ｊｕｎｇ　Ｈ　Ｗ，Ｋｉｍ　Ｋ　Ｄ，Ｈｗａｎｇ　Ｂ　Ｋ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｐａｔｈｏｇｅｎ　ｒｅ—　ｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｅｐｐｅｒ　ｌｉｐｉｄ　ｒｔａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ（ＣＡＬ　，）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＡＬＴＰＩ　ｒｔａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｐｌａｎｔａ，２００５，２２　ｌ：３６　１．７３　［１４］Ｌｕ　Ｚ　Ｘ，Ｇａｕｄｅｔ　Ｄ，Ｐｕｃｈａｌｓｋｉ　Ｂ，Ｄｅｓｐｉｎｓ　Ｆｒｉｃｋ　Ｍ，Ｌａｒｏｃｈｅ　Ａ．　Ｉｎｄｕｃｅｒｓ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔｎａｃｅ　ｒｅｄｕｃｅ　ｃｏｍｍｏｎ　ｂｕｎｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｈｉｌｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｄｅｆｅｎｃｅ・ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ，２００６，６７：１３８—１４８　［１５］Ｓａｗａｎｏ　Ｙ，Ｈａｔａｎｏ　Ｋ，Ｍｉｙａｋａｗａ　Ｔ，Ｋｏｍａｇａｔａ　Ｈ，Ｍｉｙａｕｃｈｉ　Ｙ，　Ｙａｍａｚａｋｉ　Ｈ，Ｔａｎｏｋｕｒａ　Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｆｒｏｍ　ｇｉｎｋｇｏ　ｓｅｅｄｓ　ｉｓ　ａ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　ｐｌｎａｔ　ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｌｉｐｉｄ　ｒｔａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，１４６：１４０９－１９　１９　［１６］Ｍａｌｄｏｎａｄｏ　Ａ　Ｍ，Ｄｏｅｒｎｅｒ　Ｐ，Ｄｉｘｏｎ　Ｒ　Ａ，Ｌａｍｂ　Ｃ　Ｊ，Ｃａｍｅｒｏｎ　Ｒ　Ｋ．Ａ　ｐｕｍｔｉｖｅ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｒｅｓｉｓ—　ｔａｎｃｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１９：３９９－４０３　［１７］ＨｏｒｖａｔｈＢＭ，ＢａｃｈｅｍＣＷＢ，Ｔｒｉｎｄａｄｅ　ＬＭ，ＯｏｒｔｗｉｊｎＭ，Ｖｉｓ—　ｓｅｒ　Ｒ　Ｇ　Ｆ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｎ　Ｌ　ｇｅｎｅｓ　ｉｔｓｓｕｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｏｔａｔｏ　ｔｕ—　ｂｅｒ　ｌｉｆｅ　ｃｙｃｌｅ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００２，１２９：１４９４－１５０６　［１８］Ｔｒｅｖｉｉｆｏ　Ｍ　Ｂ，Ｃｏｎｎｅｌｌ　Ｍ　Ａ　Ｏ．Ｔｈｒｅｅ　ｄｒｏｕｇｈｔ・ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｍｅｍ．　ｂｅｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｌｉｐｉｄ—ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　Ｌｙ．　ｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ　ｓｈｏｗ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ尸ｈｙｓｉｏ１．１９９８．１　ｌ６：１４６１—１４６８　【１９］Ｈｅ　Ｌ　Ｙ，Ｓｅｑｕｅｋａ　Ｌ，Ｋｅｌｍａｎ　Ｓ　Ｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｎａ．Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓ，１９８３，６７：　ｌ３５７－１３６ｌ　【２０］Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｊ　Ｐ，Ｂａｄｒｕｚｓａｕｆａｒｉ　Ｅ　Ｓ，Ｐｅｅｒ　Ｍ，Ｍａｎｎｅｒｓ　Ｊ　Ｍ，Ｄｅｓ．　ｍｏｎｄ　Ｏ　Ｊ，Ｅｈｌｅｒｔ　Ｃ，Ｍａｃｌｅａｎ　Ｄ　Ｊ，Ｅｂｅｆｌ　Ｐ　Ｒ，Ｋａｚａｎ　Ｋ．Ａｎｔａｇｏ—　ｎｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｉａｓｍｏｎａｔｅ—ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｓ—　ｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ　ＣｅＩＩ．２Ｏ０４．１６：３４６０－３４７９　［２１］Ｔａｍｕｒａ　Ｋ，Ｄｕｄｌｅｙ　Ｊ，Ｎｅｉ　Ｍ，Ｋｕｍａｒ　Ｓ．ＭＥＧＡ４：Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ　ｅｖｏ・　ｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｅｖｏ１．２ｏｏ７．２４：１５９６－１５９９　［２２］Ｊａｉｎ　Ｍ，Ｋａｕｒ　Ｎ，Ｔｙａｇｉ　Ａ　Ｋ，Ｋｈｕｒｎａａ　Ｊ　Ｐ．Ｔｈｅ　ａｕｘｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ＧＨ３　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）．Ｆｕｎｃｔ　Ｉｎｔｅｇｒ　Ｇｅｎｏｍ，　２００６．６：３６＿＿４６　［２３］Ｗａｗｒｚｙｎｓｋａ　Ａ，Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋａ　Ｍ，Ｈａｗｋｅｓｆｏｒｄ　Ｍ　Ｊ，Ｓｉｒｋｏ　Ａ．　Ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｌｉｂｒａｒｙ・－ｂａｓｅｄ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｉｄｅｎ・－　ｔｉｆｙ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｇｅｎｅｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓｈ０ｎ—ｔｅｒｍ　ｓｕｌｐｈｕｒ　ｄｅｆｉｃｉｔ．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２００５，５６：１５７５—１５９０　［２４］Ｐｆａｆｉｆ　Ｍ　Ｗ．Ａ　ｎｅｗ　ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｑｕａｎｔｉｉｆｃａ．　ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＲＴ—ＰＣＲ．Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２ｏｏ　１．２９：２００２—２００７　［２５］Ｅｌｏｒｚａ　Ａ，Ｌｅｏｎ　Ｇ，Ｇｏｍｅｚ　Ｉ，Ｍｏｕｒａｓ　Ａ，Ｈｏｌｕｉｇｕｅ　Ｌ，Ａｒａｙａ　Ａ，　Ｊｏｒｄａｎａ　Ｘ．Ｎｕｃｌｅａｒ　ＳＤＨ２一Ｊ　ａｎｄ　ＳＤＨ２・２　ｇｅｎｅｓ．ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｒｏｎ—ｓｕｌｆｕｒ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ＩＩ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，　ｈａｖｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｃｅｌｌ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｃ・　ｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２ｏ０４，ｌ　３６：４０７２－４０８７　［２６］Ｋａｄｅｒ　Ｊ　Ｃ．Ｌｉｐｉｄ—ｔｒｎａｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｌｎａｔｓ．Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，１９９６，４７：６２７￣５５４　［２７］Ｈｉｎｃｈａ　Ｄ　Ｋ，Ｎｅｕｋａｍｍ　Ｂ，Ｓｒｏｒ　Ｈ　Ａ　Ｍ，Ｓｉｅｇ　Ｅ　Ｗｅｃｋｗａｒｔｈ　Ｗ　Ｒｕｃｋｅｌｓ　Ｍ，Ｌｕｌｌｉｅｎ—Ｐｅｌｌｅｒｉｎ　Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　Ｗ　Ｓｃｈｍｉｔｔ　Ｊ　Ｍ．Ｃａｂ—　ｂａｇｅ　ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎ　ｉｓ　ａ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｌｉｐｉｄ　ｒｔａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２５：８３５—８４６　［２８］Ｊｕｎｇ　Ｈ　Ｗ，Ｋｉｍ　Ｗ，Ｈｗａｎｇ　Ｂ　Ｋ．Ｔｈｒｅｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ—ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｐｅｐｐｅｒ　ｒａｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ａｃ．　ｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ａｂｉｏｔｉｃ，ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ，２００３，２６：５－９２８　［２９］ｖａｎ　Ｌｏｏｎ　Ｌ，Ｒｅｐ　Ｍ，Ｐｉｅｔｅｒｓｅ　Ｃ　Ｍ．Ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｄｅ．　ｆｅｎｓｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ．Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ，　２００６，４４：ｌ３５—１６２　［３０］Ｐａｒｋ　Ｃ　Ｊ，Ｓｈｉｎ　Ｒ，Ｐａｒｋ　Ｊ　Ｍ，Ｌｅｅ　Ｇ　Ｊ，Ｙｏｕ　Ｊ　Ｓ，Ｐａｅｋ　Ｈ　Ｐ．Ｉｎｄｕｃ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｐｐｐｅｒ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｈｔｅ　ｒｅｓｉｓｔｎａｃｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００２，　４８：２４３－２５４　［３１］Ｈｕｇｈｅｓ　Ｍ，Ｄｕｎｎ　Ｍ，Ｐｅａｒｃｅ　Ｒ，Ｗｈｉｔｅ　Ａ，Ｚｈａｎｇ　Ｌ．Ａｎ　ａｂ—　ｓｃｉｓｉｃ—ａｃｉｄ—ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ，ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｂａｒｌｅｙ　ｇｅｎｅ　ｈａｓ　ｈｏｍｏｌ—　ｏｇｙ　ｗｉｈｔ　ａ　ｍａｉｚｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｅｎｖｉ－　ｒｏｎ，１９９２，１５：８６１—８６５　［３２］Ｄｕｎｎ　Ｍ，Ｈｕｇｈｅｓ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｌ，Ｐｅａｒｃｅ　Ｒ，Ｑｕｉｇｌｅｙ　Ａ，Ｊａｃｋ　Ｐ．Ｎｕ—　ｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌｒａ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｔｅ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｒｅａｌ　ｇｅｎｅ，ＢＬＴ４．Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，１９９ｌ，２２９：３８９—３９４　［３３］Ｈｏｌｌｅｎｂａｃｈ　Ｂ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ　Ｌ，Ｈａｒｔｕｎｇ　Ｗ，Ｄｉｅｔｚ　Ｋ　Ｊ．Ｃａｄｍｉｕｍ　ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｒｔａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏ．　ｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｗａｘ　ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｐｌａｎｔａ，１９９７，２０３：９－１９　【３４］Ｈｅｐｌｅｒ　Ｐ　Ｋ．Ｃａｌｃｉｕｍ：Ａ　ｃｅｎｔｒｌａ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｐｌｎａｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２００５，１７：２１４２—２１５５　【３５］Ｂｕｈｏｔ　Ｎ，Ｇｏｍｅｓ　Ｅ，Ｍｉｌａｔ　Ｍ　Ｌ，Ｐｏｎｃｈｅｔ　Ｍ，Ｍａｒｉｏｎ　Ｄ，Ｌｅｑｕｅｕ　Ｊ，　Ｄｅｌｒｏｔ　Ｓ．Ｃｏｕｔｏｓ—ｈＴｅｖｅｎｏｔ　Ｐ　Ｂｌｅｉｎ　Ｊ　Ｐ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏ—　ｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａ　ｔｏｂａｃｃｏ　Ｌ１Ｐｌ　ｂｙ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ　Ｂ　ｆ　Ｃｅｌ１．２００４．１５：５０４７－５０５２