(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 106511460 A (43)申请公布日 2017.03.22
(21)申请号 201510581973.3(22)申请日 2015.09.14
(71)申请人天士力制药集团股份有限公司
地址300410 天津市北辰区淮河道与汀江西
路交口天之骄园区法务中心知识产权部(72)发明人周水平 马晓慧 颜璐璐 靳元鹏
李云飞 王毅 申秀萍 张莉华曹晶 罗学军 孙鹤 朱永宏(74)专利代理机构北京华科联合专利事务所
(普通合伙) 11130
代理人王为(51)Int.Cl.
A61K 36/537(2006.01)A61P 1/16(2006.01)
权利要求书1页 说明书21页 附图5页
(54)发明名称
一种治疗肝纤维化的中药组合物(57)摘要
本发明公开一种中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成：丹参提取物与三七提取物的配比为10:1～1:16，该中药组合物具有预防或治疗肝纤维化药物中的应用。
C N 1 0 6 5 1 1 4 6 0 A CN 106511460 A
权 利 要 求 书
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1.一种中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成：
丹参提取物与三七提取物的配比为10:1～1:16。2.如权利要求1所述的中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成：丹参提取物与三七提取物的配比为5:1～1:5。3.如权利要求2所述的中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成丹参提取物与三七提取物的配比为2:1～1:3。4.如权利要求3所述的中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成丹参提取物与三七提取物的配比为最优选1.4:1～1:1.5。5.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的丹参提取物是由下述方法制备：丹参饮片加3‐8倍量碱水煎煮1‐3小时，过滤，药渣中加入2‐6倍量水继续煎煮0.5‐2小时，过滤，合并两次过滤提取液，浓缩至25℃相对密度1.06‐1.10，加入80‐100％的乙醇醇沉至50‐70％，静置，取上清液浓缩至60℃相对密度1.35‐1.40，干燥即得丹参提取物。
6.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的碱水是0.45％NaHCO3的水溶液。
7.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述的三七提取物是由下述方法制备：(1)三七饮片加3‐8倍量50‐90％乙醇回流提取1‐5小时，过滤，药渣继续加3‐8倍量50‐90％乙醇回流提取1‐3小时，过滤，合并滤液，浓缩至无醇得提取浓缩液待用；(2)将提取浓缩液加入大孔吸附树脂柱中，保持流速0.3‐0.8BV/h进行上样，用水洗3‐7BV，流速1‐1.5BV/h，后用50‐70％乙醇进行洗脱，收集3BV洗脱液，浓缩至干，得到三七提取物。
8.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，还含有适量药物可接受的载体。9.如权利要求1所述的中药组合物在制备预防或治疗肝硬化药物中的应用。10.如权利要求1所述的中药组合物在制备预防或治疗肝纤维化药物中的应用。
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CN 106511460 A
说 明 书
一种治疗肝纤维化的中药组合物
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技术领域
[0001]
本发明涉及一种医药领域，尤其是涉及一种治疗肝纤维化药物。
背景技术
肝纤维化指肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积，导致肝脏结构或(和)功能异常的病理变化。肝纤维化见于大多数不同病因的慢性肝脏疾病中，进一步发展，可形成肝硬化，严重影响患者健康与生命。大部分肝病纤维化进展缓慢，病人需要长期服药，开发安全有效抗纤维化药物具有潜在巨大市场。目前，肝纤维化是个世界难题，抗肝纤维化成熟药物还不多，其治疗领域仍有着庞大的市场前景和待拓展空间。[0003] 治疗肝纤维化的药物包括西药和中药。例如秋水仙碱、水飞蓟素、熊去氧胆酸等等。中医中药以“活血化瘀，软坚散结，益气补血”为肝纤维化的治疗准则。目前以活血化瘀及扶正补虚应用得最为广泛。丹参味苦，性微寒，归心、肝经，能活血化癖，养心安神，是临床常用的活血化瘀药，其主要药理作用，包括抗炎、清除氧自由基及抗氧化等。三七味甘、微苦，性温，归肝、胃二经，具有补血活血，消肿定痛的作用。梁峰岗等人通过对1979‐2007年国内关于中医药治疗肝纤维化的学术文献进行统计，分析了中医抗肝纤维化的药证规律研究。治肝纤维化方中丹参、鳖甲、黄芪、赤芍、当归、柴胡、白术、桃仁、郁金、茯苓、三七、甘草等味中药出现的次数最多。丹参在各型肝纤维化病中使用率最高，在所有药物中排第一名，其用药频次和频率分别为61和0.7531；三七的用药频次为24，用药频率为0.2693，在所有药物中与茯苓并列排第十位。
[0004] 目前肝纤维化治疗尚无特效药物。在众多抗肝纤维化药物中，中药以多环节，多层次，多靶点的综合药理作用在肝纤维化防治方面初见端倪，是一类很有发展潜力的药物。
[0002]
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供提供了一种中药组合物，该组合物能够治疗肝纤维化。
[0006] 本发明还提供了所述的中药组合物还可以含有适量药物可接受的载体。
[0007] 本发明还提供了所述的中药组合物可与适量的药物可接受的载体制备成各种制剂。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明的丹参提取物与三七提取物的比例是通过筛选得到的，并经实验证明，在大鼠DMN肝纤维化模型实验中，本发明的丹参提取物与三七提取物各配比组，均表现良好的阻抑肝纤维化向肝硬化进展的作用，能够减少肝硬化失代偿的发生，或有助于肝硬化失代偿期向代偿期转化，降低动物死亡率及延长动物生存期。
[0005]
本发明的中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成，10:1～1:16，[0011] 优选中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成：[0012] 丹参提取物与三七提取物的配比为5:1～1:5。
[0010]
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说 明 书
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优选中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成[0014] 丹参提取物与三七提取物的配比为2:1～1:3。[0015] 最优选中药组合物，其是由下述重量份比的提取物组成
[0016] 丹参提取物与三七提取物的配比为最优选1.4:1～1:1.5。[0017] 本发明的中药组合物，最佳丹参提取物与三七提取物配比为1:1或1:3或1:16。[0018] 本发明所述的丹参提取物、三七提取物为现有技术，可以市购。为了更好达到更好的药效结果，优选是由下述方法制备。[0019] 丹参提取物的制备：取丹参饮片加3‐8倍量碱水煎煮1‐3小时，过滤，药渣中加入2‐6倍量水继续煎煮0.5‐2小时，过滤，合并两次过滤提取液，浓缩至25℃相对密度1.06‐1.10，加入80‐100％的乙醇醇沉至50‐70％，静置，取上清液浓缩至60℃相对密度1.35‐1.40，干燥即得丹参提取物。
[0020] 所述的碱水包括但不限于氨水溶液。氢氧化钠水溶液，碳酸氢钠水溶液，优选0.45％NaHCO3的水溶液。[0021] 优选方法，丹参饮片加5倍量水(+水量0.45％NaHCO3)煎煮2小时，300目滤布过滤，药渣中加入4倍量水继续煎煮1小时，300目滤布过滤，合并两次过滤提取液，浓缩至RD1.06-1.10(25℃)，加入95％的乙醇醇沉至60％，静置12小时，取上清液浓缩至RD1.35-1.40(60℃)，即得丹参提取物。[0022] 所述的三七提取物的制备方法：(1)三七饮片加3-8倍量50-90％乙醇回流提 取1-5小时，过滤，药渣继续加3-8倍量50-90％乙醇回流提取1-3小时，过滤，合并滤液，浓缩至无醇得提取浓缩液待用；(2)将提取浓缩液加入大孔吸附树脂柱中，保持流速0.3-0.8BV/h进行上样，用水洗3-7BV，流速1-1.5BV/h，后用50-70％乙醇进行洗脱，收集3BV洗脱液，浓缩至干，得到三七提取物。
[0023] 所述的大孔树脂包括但不限于所述的树脂柱型号包括但不限于AB－8柱、D101柱、D201柱、D301柱、HPD100柱、HPD300柱、HPD600柱、NKA-9柱、DA201型、D—型、SIP系列、X—5型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD—40型、DM—130型、R—A型、CHA—111型、WLD型(混合型)、H107型等。优选D101型。[0024] 所述的树脂柱预处理，取大孔树脂柱，乙醇膨胀，水洗后装入玻璃柱中，备用待上样。
[0025] 优选三七提取物的制备方法，三七饮片加6倍量70％乙醇回流提取2.5小时，300目滤布过滤，药渣继续加5倍量70％乙醇回流提取2小时，过滤，合并滤液，浓缩至无醇的浓缩液；取6kg D101大孔吸附树脂，乙醇溶胀12小时以上，水洗5‐8遍，装入玻璃柱中，待上样；将提取浓缩液加入柱中，保持流速0.5BV/h进行上样，用水洗5BV，流速1‐1.5BV/h，用70％乙醇进行洗脱，收集3BV洗脱液，浓缩至干，即得。[0026] 所述的BV是指倍量填充树脂的体积。
[0027] 本发明的中药组合物以制成含有丹参提取物和三七提取物为活性成分的中药组合物。
本发明的中药组合物，还可以制成药学上可接受的制剂，其中中药组合物在药物
制剂中所占重量百分比为0.1～99.9％，其余为药物可接受的载体。[0029] 本发明的中药组合物以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，
[0028]
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说 明 书
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如片剂的每片、胶囊的每粒等，
[0030] 本发明的制剂包括但不限于片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。[0031] 发明的中药组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、 填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。[0032] 适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
[0033] 口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。[0034] 对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。[0035] 本发明的中药组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。[0036] 本发明的中药组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片，每剂1mg-1000mg。
[0037] 本发明的中药组合物具有预防和治疗肝纤维化作用，还具对急性肝损伤的保护作用。
[0038] 本发明的中药组合物中丹参提取物与三七提取物的比例是通过筛选得到的，并经实验证明，在大鼠DMN肝纤维化模型实验中，本发明的丹参提取物与三七提取物各配比组，均表现良好的阻抑肝纤维化向肝硬化进展的作用，能够减少肝硬化失代偿的发生，或有助于肝硬化失代偿期向代偿期转化，降低动物死亡率及延长动物生存期。[0039] 通过下述试验例阐述本发明的有益效果。
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试验例一对肝纤维化的保护(配伍实验)[0041] 1.实验材料[0042] 1.1样品：丹参提取物、三七提取物按照实施例1制备
[0043] 阳性对照药秋水仙碱均由天津天士力药业股份有限公司提供，溶于水，口服给药。[0044] 1.2二甲基亚硝胺(DMN)：日本Kasei Kogyo化学株式会社产品，无菌生理盐水稀释，腹腔注射给药。
[0045] 1.3 Wistar大鼠，雄性，140-170g，购自北京维通利华公司，动物饲养于GLP动物饲养室。
[0046] 2.实验方法[0047] 大鼠115只，除预留10只空白对照组大鼠，其余大鼠每周第1‐3天，腹腔注射0.5％DMN生理盐水稀释液2ml/kg，注射3周加1天。将造模成功大鼠随机分组，分组情况见表1，各剂量组均口服给药，每天1次，共给药3周，模型组及空白对照组给予相同量的溶剂水。给药期间观察动物状态，每3‐4天记录动物体重。于末次给药后2h，处死动物，取血制备血清，检测血清透明质酸、Ⅲ型前胶原N端肽、Ⅳ型胶原、ALT、AST、总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶、胆汁酸、白蛋白及总蛋白等含量，取肝大叶进行病理检查，制备肝脏匀浆检测羟脯氨酸含量。以病理学分级及血清透明质酸等含量作为药物药效评价标准。[0048] 肝脏病理主要组织病变类型和分度如下：[0049] (1)肝细胞变性表现为：肝细胞浊肿、脂肪变或空泡变性。病变范围在肝小叶 <1/3为轻度(+)，病变占肝小叶2/3左右为中度(++)；病变>肝小叶2/3为重度(+++)。[0050] (2)肝细胞坏死细胞学特征改变为：胞浆着色呈浅粉红色，胞浆空虚，胞膜薄，胞核多崩解，碎裂或降解，呈液化性坏死，部分肝细胞固缩胞浆深红染，胞核固缩，呈凝固性坏死。病变范围在肝小叶<1/3为轻度(+)，病变占肝小叶2/3左右为中度(++)；病变>肝小叶2/3为重度(+++)。
[0051] (3)肝细胞再生主要表现为肝细胞和呈双核肝细胞，胞核较大，深染，核膜及染色质增厚，增大，偶见有丝核分裂相。
[0052] (4)个别肝脏标本肝小叶内可见灶性或斑片状出血，多为解剖动物时损伤所致。[0053] (5)肝淋巴细胞浸润灶：多见于肝小叶内肝窦淋巴细胞灶或斑片状淋巴细胞浸润灶，该变化多见于实验动物病毒性肝炎变化(动物常见自发病)。[0054] (6)肝间质纤维组织增生包括肝窦部星状细胞增生，和肝小叶周围纤维组织增生。有事伴有肝内小血管增生。根据肝间质纤维组织增生分布范围，灶性分布为轻度)+)；斑片状分布，包围肝小叶为中度(++)；大范围广泛纤维组织增生，包围肝小叶为重度(+++)，重度纤维组织增生多形成肝假小叶(肝硬化早期表现)。[0055] (7)肝内小胆管增生：病变范围在门脉区小胆管灶性增生分布为轻度(+)；斑片状分布为中度(++)；肝内小胆管广泛大范围增生，伴有胆管扩张和肝硬化为重度(+++)。[0056] (8)肝硬化病理特征为正常肝小叶结构破坏，纤维组织将肝小叶包裹，分割肝小叶，并有肝假小叶形成。
[0057] [0058]
表1配比实验分组情况。
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[0059]
3.实验结果
[0061] 3.1动物体重变化、腹水及肝脾情况[0062] 动物分组、体重变化及剩余动物数见表2。在治疗给药过程中，除空白对照组动物，其他各组动物均有死亡，但死亡较DMN造模4周显著减轻，至实验结束，模型组动物死亡率为26.7％，配伍1组和配伍4组动物死亡率均为20％，较模型组有改善，配伍2、3、5组动物死亡率无降低。
[0063] 本次配伍实验中，处理动物时亦发现动物腹水和肝脾肿大问题，但动物腹水发生率及严重程度较上次实验均明显减轻，有腹水亦量少。各组动物腹水发生率及肝脾肿大率见表3。配伍2组和配伍4组动物腹水和肝脾肿大发生率较模型组明显改善，其中配伍2组腹水发生率仅为18.2％，与秋水仙碱组相当，模型组为45.5％。秋水仙碱组降低肝脾肿大率的作用优于各配伍给药组。[0064] 表2分组情况及体重数据
[0060] [0065]
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[0066] [0067]
表3各组动物腹水率和肝脾肿大率
3.2血清转氨酶水平
[0069] 结果见表4。DMN模型组动物血清转氨酶ALT、AST含量较空白对照组显著升高，各配比给药组均能显著降低血清ALT含量，配比1组和配比4组亦能显著降低血清AST水平。[0070] 表4血清转氨酶含量
[0068]
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[0072]
P＜0.01，与空白对照组比较。
###
[0074] P＜0.05，P＜0.01，与模型组比较。[0075] 3.3血清总蛋白及白蛋白含量
[0076] 结果见表5。DMN模型组动物血清总蛋白(TP)含量及白蛋白(ALB)含量较空白对照组均有所下降，ALB下降相对明显，配比2、3、5组有升高TP和ALB的趋势，其中配比5组与模型组比较有统计学差异，秋水仙碱组有升高ALB的趋势。其他给药组无显著作用。[0077] 表5血清总蛋白及白蛋白含量
[0073] [0078]
**
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P＜0.05，与模型组比较。[0080] 3.4血清胆红素含量
[0081] 结果见表6。DMN模型组动物血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL) 与空白对照组比较均显著升高，动物出现黄疸。丹参提取物和三七提取物各配比治疗给药组均能明显降低血清TBIL和DBIL的含量，配比1、2、4、5组对DBIL和TBIL的降低作用与模型组比较均有统计学差异，配比2组活性更佳。秋水仙碱亦能显著降低血清TBIL和DBIL含量。[0082] 表6血清胆红素含量
[0079] [0083]
#
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P＜0.05，P＜0.01，与空白对照组比较。###
[0085] P＜0.05，P＜0.01，与模型组比较。[0086] 3.5血清胆汁酸含量[0087] 结果见表7。模型组动物血清胆汁酸(TBA)含量较空白对照组显著升高，配比各给药组和秋水仙碱组均能显著降低血清TBA含量，与模型组比较均有统计学意义，配比2组作用更佳，活性略优于秋水仙碱。提示，丹参提取物、三七提取物各配比组对肝肿大或门脉高压引起的胆汁排泄问题有良好改善作用。[0088] 表7血清胆汁酸含量
[0084]
*
[0089]
[0090]
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P＜0.01，与空白对照组比较。
##
[0092] P＜0.01，与模型组比较。[0093] 3.6血清碱性磷酸酶含量[0094] 结果见表8。模型组血清碱性磷酸酶(ALP)含量较空白对照组显著升高，丹参提取物、三七提取物各配比组均能显著降低血清ALP水平，其中配比4组作用更佳。秋水仙碱治疗组动物血清ALP含量较模型组亦显著降低.[0095] 表8血清碱性磷酸酶含量
[0091] [0096]
**
[0097]
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[0098] [0099]
**##
P＜0.01，与空白对照组比较。
P＜0.01，与模型组比较。[0100] 3.7血清透明质酸含量
[0101] 结果见表9。DMN诱发的肝纤维化肝硬化大鼠血清透明质酸(HA)含量较空白对照组显著升高，丹参提取物、三七提取物配比1、2、3、4组动物血清HA含量较模型组均显著降低，配比2组和配比4组作用相当略佳，配比5组有降低的趋势但无统计学差异。秋水仙碱给药组动物血清HA含量亦显著降低。[0102] 表9血清透明质酸含量
[0103]
P＜0.05，与空白对照组比较；###
[0105] P＜0.05，P＜0.01，与模型组比较。[0106] 3.8血清III型前胶原N端肽含量
[0107] 结果见表10。DMN模型组动物血清III型前胶原N端肽(PIIINP)含量较空 白对照组显著升高，各配比组、秋水仙碱组均能显著降低血清PIIINP的含量。[0108] 表10血清III型前胶原肽含量
[0104] [0109]
*
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P＜0.01，与空白对照组比较；
###
[0111] P＜0.05，P＜0.01，与模型组比较。[0112] 3.9血清Ⅳ型胶原含量
[0113] 结果见表11。DMN模型组动物血清Ⅳ型胶原含量较空白对照组显著升高，各配比组和秋水仙碱组均能显著降低血清Ⅳ型胶原的含量，配比4组作用略优。[0114] 表11血清Ⅳ型胶原含量
[0110] [0115]
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[0116]
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P＜0.01，与空白对照组比较；
###
[0118] P＜0.05，P＜0.01，与模型组比较。[0119] 3.10肝组织羟脯氨酸含量
[0120] 结果见表12。DMN诱发的肝纤维化肝硬化大鼠肝组织内羟脯氨酸(Hyp)含量较空白对照组极显著升高，丹参提取物、三七提取物各配比给药组动物肝组织内Hyp含量较模型组均降低，其中配比1、2、3、4与模型组比较有统计学差异。秋水仙碱亦能显著降低DMN诱发大鼠肝纤维肝脏内Hyp的含量。
[0117] [0121] [0122]
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表12肝脏羟脯氨酸含量
P＜0.05，与空白对照组比较；#
[0124] P＜0.05，与模型组比较。[0125] 3.11病理检查结果[0126] 病理检查结果如下：详细的病理观察表和各组动物肝脏组织病理变化发生例数观察比较表见表13‐15，病理图片见图1‐8。正常组：10例大鼠肝组织标本。肝细胞呈放射
[0123]
15
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性索状排列，部分肝细胞可见轻度变性和坏死(由取材所致)，肝汇管区和肝门脉组织结构未见异常病理变化，肝内动、静脉未见明显扩张，淤血和血栓形成，血管平滑肌未见明显增厚和纤维细胞增生，肝细胞间质无纤维组织增生或纤维化。部分标本肝小叶内可见散在淋巴细胞浸润灶(动物常见自发病)。[0127] 1.DMN模型组：11例大鼠肝组织标本。肝细胞排列呈放射性索状排列，肝细胞可见不同程度变性和坏死，一部分肝细胞可见增生。肝间质可见片状出血及炎细胞浸润，肝窦扩张和充血明显。肝间质均可见纤维组织增生，肝假小叶形成，肝硬化明显，但多为早期肝硬化，肝假小叶形成纤维包膜较薄。部分标本可见胆小管轻度增生。[0128] 2.不同治疗组：每组11-12例大鼠肝组织标本。肝细胞呈放射状排列，肝细胞不同程度变性，其中治疗2组和治疗3组程度较轻，其它治疗组程度较重，各组未见肝细胞坏死和增生。肝间质偶见出血和炎细胞浸润(动物常自发病)，肝窦未见扩张和充血。大部分肝组织标本未见肝间质纤维组织增生，治疗2组和治疗3组部分标本仅有轻度增生，治疗1组、治疗4组、治疗5组有轻度-中度增生。偶见胆小管轻度增生。各组标本病变程度均较模型组明显减轻。
[0129] 3.秋水仙碱组：12例大鼠肝脏组织标本。该组病变程度较模型组减轻。肝细胞病理性改变，包括不同程度的肝细胞发生浊肿、变性和肝细胞坏死，肝细胞有再生现象。部分标本肝细胞间质可见出血灶(解剖损伤)和淋巴细胞浸润灶(动物常见自发病)。肝间质纤维组织增生程度较治疗组重，但较模型组轻，部分形成肝内假小叶病理学特征。未见胆小管增生现象。
[0130] 表13各组动物肝细胞病理变化发生例数和程度观察比较
[0131]
[0132]
[0133] [0134]
表14各组动物肝细胞病理变化发生例数和程度观察比较
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[0135] [0136]
表15各组动物肝纤维化病理变化发生例数和程度观察比较
试验例二丹参组分抗大鼠肝脏纤维化配伍优化研究[0137] 1.标准化数据
[0138] 实验数据分为主要因素和次要因素两组。[0139] 标准化方程：
[0140] [0141]
对于模型组与正常组指标绝对值差值较小的指标，用以下方程标准化：
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模型组标准化值为0；
[0143] 表16针对3个主要指标透明质酸含量(HA)、胶原含量(pIIINP)和羟脯氨酸含量(TBA)，得到标准化数据为
[0142] [0144]
2.各主要指标分别拟合
[0146] 拟合函数定义为Y＝aX1＋bX2＋cX1X2；[0147] Minitab软件广义回归，得到abc系数值；[0148] 三个回归函数如下：
2
[0149] HA:y1＝1.46464x2＋1.38183x2-0.02294x1x2-0.00392,R＝0.7968[0150] PⅢNP:y2＝-0.115873x1-0.006102x2＋0.022134x1x2＋0.001372，R2＝0.8318[0151] TBA:y3＝0.957656x1＋0.718142x2＋0.029617x1x2＋0.007342，R2＝0.7754[0152] 3.Matlab GA基因算法优化多目标方程
[0153] HA:y1-1.46464x1+1.38183x2-0.02294x1x2-0.00392，R2＝0.7968[0154] PⅢNP:y2--0.115873x1-0.006102x2+0.022134x1x2+0.001372，R2＝0.8318[0155] TBA:y3-0.957656x1+0.718142x2+0.029617x1x2+0.007342，R2＝0.7754[0156] 综合指标方程为Y-(y1+y2+y3)/3，得到以下优化等值响应图9.[0157] 根据优化数据结果，在总给药量固定为60mg/kg时，区域1建议丹I与丹II比例为10:50，区域2建议丹I与丹II比例为30:30；区域3建议丹I与丹II比例为35:25，区域4建议比例为50:10。区域1与4处于极值边缘，作为配伍优化，较推荐区域2与3的取值，特别是等比比值附近的配伍比例剂量取值。[0158] 试验例三对肝纤维化的保护(验证实验)[0159] 1.实验材料[0160] 1.1样品：丹参提取物、三七提取物按照实施例1制备
[0161] 阳性对照药秋水仙碱均由天津天士力药业股份有限公司提供，溶于水，口服给药。[0162] 1.2二甲基亚硝胺(DMN)：日本Kasei Kogyo化学株式会社产品，无菌生理盐水稀释，腹腔注射给药。
[0145]
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1.3 Wistar大鼠，雄性，140-170g，购自北京维通利华公司，动物饲养于GLP动物
饲养室。
2.实验方法[0165] 大鼠55只，除预留10只空白对照组大鼠，其余大鼠每周第1‐3天，腹腔注射0.5％DMN生理盐水稀释液2ml/kg，注射3周加1天。将造模成功大鼠随机分组，分组情况见表1，各剂量组均口服给药，每天1次，共给药3周，模型组及空白对照组给予相同量的溶剂水。给药期间观察动物状态，每3‐4天记录动物体重。于末次给药后2h，处死动物，取血制备血清，取肝大叶进行病理检查，制备肝脏匀浆检测羟脯氨酸含量。检测血清透明质酸等主要指标含量。
[0166] 3.实验结果
[0167] 结果见表16。DMN诱发的肝纤维化肝硬化大鼠血清透明质酸(HA)、III型前胶原N端肽(PIIINP)和肝组织内羟脯氨酸(Hyp)含量较空白对照组显著升高，丹参提取物、三七提取物配比组动物血清HA含量、PIIINP含量和肝脏中Hyp 较模型组均显著降低。[0168] 表17血清HA、PIIINP和肝组织Hyp含量
[0164] [0169]
P＜0.01，与空白对照组比较；
###
[0171] P＜0.05，P＜0.01，与模型组比较。[0172] 试验例四、本发明的中药组合物抑制肝脏星状细胞的活化及增殖作用
[0170]
**
1.实验材料[0174] 1.1样品：丹参提取物、三七提取物(按照实施例1方法制备)，均用DMSO配制成一定浓度储备液，4℃保存。[0175] 1.2细胞株：大鼠肝星状细胞HSC‐T6，在含10％进口胎牛血清的DMEM培养液(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)中生长，培养条件为37℃、5％CO2，饱和湿度。用含
[0173]
0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA液消化传代[0176] 2实验方法[0177] 丹参提取物、三七提取物独用、合同对TGF‐β1引起HSC‐T6细胞增殖的影响[0178] HSC‐T6细胞接种于96孔细胞培养板，培养24h后，撤原培养基换含0.5％进口胎牛血清的DMEM培养液，继续培养细胞24h，加入不同浓度丹参提取物、三七提取物，同时加
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入2ng/ml TGF‐β1刺激细胞。作用细胞48h后，弃去培养液，每孔加入MTT(0.5mg/ml)液100μl，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入DMSO150μl，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。细胞存活率(％)＝100％×(给药组OD值/溶剂对照组OD值)。细胞增殖抑制百分率(％)＝100％×(TGF‐β1组细胞存活率‐待测物组细胞存活率)/TGF‐β1组细胞存活率。
[0179] 3实验结果见表18-表20
[0180] 抑制肝脏星状细胞的活化及增殖是目前抗肝纤维化药物的作用重要靶点。丹参提取物、三七提取物在体外对TGF-β引起HSC-T6细胞增殖作用进行了研究，从抗星状细胞活化的角度初步探讨提取物抗肝纤维化的作用机制。结果显示，结果显示，丹参提取物、三七提取物对TGF‐β引起的细胞活化有一定的抑制作用。
[0181] 表18丹参提取物对TGF‐β1引起HSC‐T6细胞增殖的影响
[0182]
PP＜0.001，与溶剂对照组比较；
[0184] **P＜0.01，与TGF‐β比较。
[0185] 表19三七提取物对TGF‐β1引起HSC‐T6细胞增殖的影响
[0183] [0186]
###
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CN 106511460 A[0187]
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*P＜0.05，**P＜0.01，与溶剂对照组比较。[0188] 表20丹参提取物、三七提取物合用对TGF-β引起HSC-T6细胞增殖的影响
[0189]
本发明权利要求书保护范围内所有的及具体实施例中的中药组合物都具有上述作用及其效果。
[0190]
附图说明
附图1空白对照组动物肝脏组织病理变化图片，肝小叶肝细胞索呈放射状分布，
肝脏组织内肝小叶和汇管结构未见明显异常,肝细胞未见明显变性和坏死HE×200[0192] 附图2 DMN模型组动物肝脏组织病理变化图片，肝细胞空泡变性，可见坏死，汇管区结构紊乱，肝细胞间质可见明显纤维组织增生，假小叶形成，可见斑片状出血，胆小管未见明显增生HE×200
[0193] 附图3秋水仙碱组动物肝脏组织病理变化图片，肝细胞浊肿，空泡变性和坏死，肝间质可见纤维组织明显增生，肝窦内可见淋巴细胞浸润灶HE×200[0194] 附图4配比1组动物肝脏组织病理变化图片，肝索结构紊乱，肝细胞浊肿，变性和坏死明显，肝细胞间质可见纤维组织增生，未见胆小管增生HE×200[0195] 附图5配比2组动物肝脏组织病理变化图片，肝索结构紊乱，肝细胞空泡变性和坏死，肝细胞间质可见轻度纤维组织增生HE×200
[0196] 附图6配比3组动物肝脏组织病理变化图片，肝细胞轻度变性，肝间质未可见轻度纤维组织增生，未见小胆管增生，肝窦未见扩张和充血HE×200[0197] 附图7配比4组动物肝脏组织病理变化图片，肝细胞可见变性。肝间质可见纤维组织增生，肝窦未见扩张和充血，未见小胆管增生HE×200[0198] 附图8配比5组动物肝脏组织病理变化图片，肝细胞可见轻度变性，肝细胞索呈放射状排列，肝间质未见明显纤维组织增生，肝窦未见扩张和充血，肝窦内可见淋巴细胞浸润灶(动物自发病)HE×200
[0199] 附图9优化等值响应图
[0191]
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具体实施方式
[0200] 下面以具体实施例来说明本发明，实施例是为了便于理解本发明，而不是以任何方式限制本发明的权利要求和核心内容。[0201] 实施例1、丹参提取物、三七提取物的制备
[0202] 取3.828kg丹参饮片加5倍量水(+水量0.45％NaHCO3)煎煮2小时，300目滤布过滤，药渣中加入4倍量水继续煎煮1小时，300目滤布过滤，合并两次过滤提取液，浓缩至RD1.06‐1.10(25℃)，加入95％的乙醇醇沉至60％，静置12小时，取上清液浓缩至RD1.35‐1.40(60℃)，即得丹参提取物1.557kg。
[0203] 三七饮片加6倍量70％乙醇回流提取2.5小时，300目滤布过滤，药渣继续加5倍量70％乙醇回流提取2小时，过滤，合并滤液，浓缩至无醇。共提取6.5kg。取6kg D101大孔吸附树脂，乙醇溶胀12小时以上，水洗5‐8遍，装入玻璃柱中，待上样。将提取浓缩液加入柱中，保持流速0.5BV/h进行上样。用水洗5BV，流速1‐1.5BV/h。用70％乙醇进行洗脱，收集3BV洗脱液，浓缩至干，得到620g三七提取物，收率9.54％。[0204] 实施例2、丹参提取物、三七提取物的制备[0205] 丹参饮片加3倍量氨水煎煮1小时，过滤，药渣中加入2倍量水继续煎煮0.5小时，过滤，合并两次过滤提取液，浓缩至25℃相对密度1.06‐1.10，加入80％的乙醇醇沉至50％，静置，取上清液浓缩至60℃相对密度1.35‐1.40，干燥即得丹参提取物。[0206] 三七饮片加3倍量50％乙醇回流提取1小时，过滤，药渣继续加3倍量50％乙醇回流提取1小时，过滤，合并滤液，浓缩至无醇得提取浓缩液待用；(2)将提取浓缩液加入大孔吸附树脂柱中，保持流速0.3BV/h进行上样，用水洗3BV，流速1BV/h，后用50％乙醇进行洗脱，收集3BV洗脱液，浓缩至干，得到三七提取物。[0207] 实施例3、丹参提取物、三七提取物的制备[0208] 丹参饮片加8倍量碱水煎煮3小时，过滤，药渣中加入6倍量水继续煎煮2小时，过滤，合并两次过滤提取液，浓缩至25℃相对密度1.06‐1.10，加入乙醇醇沉至％，静置，取上清液浓缩至60℃相对密度1.35‐1.40，干燥即得丹参提取物。[0209] 三七饮片加8倍量90％乙醇回流提取5小时，过滤，药渣继续加8倍量90％乙醇回流提取3小时，过滤，合并滤液，浓缩至无醇得提取浓缩液待用；取浓缩液加入大孔吸附树脂柱中，保持流速0.8BV/h进行上样，用水洗7BV，流速1.5BV/h，后用70％乙醇进行洗脱，收集3BV洗脱液，浓缩至干即得三七提取物。[0210] 实施例4本发明的中药组合物[0211] 取实施例1的丹参提取物2600g、三七提取物3720g、混合均匀即可。[0212] 实施例5本发明的中药组合物[0213] 取实施例1的丹参提取物420g、三七提取物6720g、混合均匀即可。[0214] 实施例6本发明的中药组合物[0215] 取实施例1的丹参提取物4930g、三七提取物510g、混合均匀即可。实施例7本发明的中药组合物[0217] 取实施例1的丹参提取物1700g、三七提取物4960g、混合均匀即可。[0218] 实施例8本发明的中药组合物
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取实施例1的丹参提取物3710g、三七提取物2190g、混合均匀即可。[0220] 实施例9本发明的中药组合物[0221] 取实施例1的丹参提取物5000g、三七提取物5000g、混合均匀即可。[0222] 实施例10本发明的中药组合物[0223] 取实施例2的丹参提取物3500g、三七提取物2500g、混合均匀即可。[0224] 实施例11本发明的中药组合物[0225] 取实施例2的丹参提取物1000g、三七提取物5000g、混合均匀即可。[0226] 实施例12本发明的中药组合物[0227] 取实施例3的丹参提取物5000g、三七提取物1000g、混合均匀即可。[0228] 实施例13本发明的中药组合物[0229] 取实施例3的丹参提取物1000g、三七提取物500g、混合均匀即可。[0230] 实施例14制剂实施例
[0231] 取产品实施例4-13任意一种中药组合物0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6-8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。[0232] 实施例15制剂实施例
[0233] 取产品实施例4-13任意一种中药组合物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。[0234] 实施例16制剂实施例
[0235] 取产品实施例4-13任意一种中药组合物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300支，即得。[0236] 实施例17制剂实施例
[0237] 取产品实施例4-13任意一种中药组合物0.5g、淀粉50g、蔗糖50g，上述组分混匀后，制粒，压片即得片剂。
[0238] 实施例18制剂实施例
[0239] 取产品实施例4-13任意一种中药组合物0.5g、淀粉50g、蔗糖50g，上述组分混匀后，制粒，装胶囊即得胶囊剂。
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