电镜和荧光显微技术在细胞凋亡研究中的应用

JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)　Vol.35　No.1　Feb.2003・91・

・技术方法・

电镜和荧光显微技术在细胞凋亡研究中的应用

王盛兰,钟延丰△,管增伟,王　薇,廖松林

(北京大学基础医学院病理学系,北京　100083)[关键词]凋亡;显微镜检查,电子;显微镜检查,荧光

[摘　要]目的:探讨荧光显微技术在检测细胞凋亡中的作用。方法:应用拓扑异构酶Ⅱ抑制剂VP216及化学毒物

叠氮钠分别诱导HL260细胞凋亡和死亡,用透射电镜和经Hoechst33258染色的荧光显微镜对凋亡及死亡动态观察和定量分析。结果:HL260细胞在VP16处理后,荧光显微镜下可见核浓缩、染色质凝聚、核碎裂等凋亡特征;而叠氮钠诱导的细胞死亡则出现核溶解、核染色质弥散,但无上述改变;两者电镜的观察与荧光显微镜的改变一致;凋亡细胞及坏死细胞荧光显微镜下呈不同的形态特征。对处理的不同时间点细胞的荧光显微镜观察发现:处理后

4h核形态开始变化,有核浓缩的细胞比例在处理的8h达高峰,然后下降,核碎裂细胞的比例在24h达高峰,约占80%,表明核浓缩发生在核碎裂之前。结论:荧光显微镜技术可明确观察判断细胞凋亡及坏死,并可进行动态及定量分析,是良好的凋亡检测方法。

[中图分类号]Q255　　[文献标识码]B　　[文章编号]16712167X(2003)0120091203Continualandquantitativeanalysisofcellularapoptosisbyelectronandfluorescencemicroscope

WANGShenglan,ZHONGYanfeng△,GUANZengwei,WANGWei,LIAOSonglin

(DepartmentofPathology,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalSciences,Beijing100083,China)KEYWORDS　Apoptosis;Microscopy,electron;Microscope,fluorescence

SUMMARY　Objective:Toevaluatetheusageoffluorescentmicroscopeinanalyzingcellularapoptosis.

)andAzardSodium(NaN3,thechemicaltoxicagent)wereMethods:VP16(theinhibitorofTop2Ⅱ

usedtoinducecellularapoptosisandnecrosisrespectively.Thecellularchangeswereanalyzedcontinu2allyandquantitativelybytransmissionelectromicroscopeandfluorescentmicroscopestainedbyHoechst33258.Results:Undertheobservationoffluorescentmicroscopeandelectromicroscope,HL60cellsshowedpyknosis,chromatinaggregationandkaryorrhexis(thefeaturesofapoptosis)intheinductionofVP16;whereasthecellsintheinductionofNaN3presentednecroticchangesofkaryolysisandchro2matindiffusion.Thisindicatedthatthereweredifferentfeaturesincellularapoptosisandnecrosisun2derfluorescentmicroscope.Inatimecourseobservationoffluorescentmicroscope,thepyknosisbeganat4hafterinductionandpeakedat8h,whereaskaryorrheixreached80%at24h,suggestingthatthepyknosisprecededthekaryorrheix.Conclusion:Thefluorescentmicroscopicobservationisatech2niqueincontinualandquantitativeanalysisofapoptosis,whichmaybeusedtodistinguishthecellularapoptosisandnecrosis.

(JPekingUniv[HealthSci],2003,35:91293)

是最直接、简便和有效的方法。Hoechst33258荧光素为

DNA亲合染料并可于凋亡早期进入细胞。本文应用拓扑异

　　凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程,同生长分化一样是多细胞生物生命活动中不可缺少的过程[1]。凋亡可通过形态学观察、DNA断片化分析及凋亡相关分子检测等确定。但在形态认定的基础上对凋亡细胞的定量分析仍

构酶Ⅱ抑制剂VP216和叠氮钠分别诱导HL260细胞的凋亡及坏死,运用透射电镜和荧光显微镜下观察形态变化,探讨

基金项目:国家自然科学基金(39770269)、北京大学985基金资助SupportedbytheNationalNaturalSciencesFoundationofChina

(39770269)and“985”FoundationofPekingUniversity

△Correspondingauthortel,010262091445

北京大学学报(医学版)

・92・JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)　Vol.35　No.1　Feb.2003

凋亡和坏死过程中形态特征的动态变化及荧光方法定量检测细胞凋亡的可行性。

1　材料与方法1.1　细胞培养

Epon812系列包埋固定,超薄切片用醋酸铀及柠檬酸铅染

色,H2500电镜(日本电子)下观察、拍照。

2　结果

2.1　VP16诱导细胞凋亡

人早幼粒细胞白血病细胞株HL260细胞由北京大学天然药物国家重点实验室提供。细胞于含100g・L-1热灭活小牛血清(北京北郊农场产品)及100mg・L-1青霉素、100

mg・L-1链霉素的RPMI1640培养液中,在37℃含5%(体

电镜观察:培养细胞在用VP16处理后,电镜下可见典型的凋亡形态特征:核浓缩或染色质边集,或核碎裂,而细胞膜、核膜及线粒体形态保持完整(图1)。

积分数)CO2的饱和湿度孵育箱中培养。

1.2　细胞凋亡及坏死的诱导

VP16(连云港制药厂产品950259)在实验前用乙醇新鲜

配置为200mmol・L-1,终浓度为0.6mmol・L-1;NaN3用蒸馏水配置为3mol・L-1,室温保存,终浓度为30mmol・L-1。对数增长期细胞,离心,换液,同时加上述药物处理,在不同作用时间点收集细胞进行形态学观察和流式细胞术检测。

1.3　荧光显微镜观察

Hoechst33258(Sigma)用蒸馏水配置为1g・L-1质量浓TheHL260cellspresentcharacteristicsofapoptosisintreatmentofVP16:thecondensationandmarginationofthechromatinonnuclearmembrane,whereasnochangesincellularorgansandmembrane.

度,以终质量浓度10mg・L-1加入细胞培养液中,在37℃下染色30min后,用多聚甲醛固定,将细胞沉淀涂于玻片上,用指甲油封片进行观察。此外,用Hoechst33258(1mg・L-1)染色7min,用PBS洗涤,然后用PI5mg・L-1再染5min,细胞立即在玻片上观察,计数PI+的核形态正常、核浓缩或核碎裂的细胞数。荧光显微镜(Leica公司),图像分析仪(Leica公司)。分析均计数1000个细胞。

1.4　透射电镜观察

图1　电镜观察VP16诱导的HL260细胞凋亡　×8000

Figure1　HL260apoptosis2inducedbyVP16

underelectromicroscope　×8000

　　荧光显微镜观察:用Hoechst33258染色,在荧光显微镜下观察细胞核形态,可见正常细胞核边界规则整齐,染色质均匀分布(图2a);用VP16处理后,可见细胞核碎裂或浓缩,

取20×10培养细胞,迅速用1g・L

g・L

-1

6-1

戊二醛原位固定蔗糖冲洗液冲洗

-1

与电镜的结果一致(图2b)。

2.2　NaN3诱导细胞坏死

30min,置细胞于离心管中,低速离心后向沉淀中加入1.5

戊二醛继续固定1h,用0.18mol・L

-1

-1

电镜观察:NaN3处理的细胞其细胞膜及核膜完整性破坏,出现核溶解或染色质呈絮状凝集,细胞浆降解,线粒体肿胀等细胞坏死的形态改变。荧光显微镜观察:NaN3处理后,可见核形态弥散且不规整,未见染色质凝聚现象(图2c)。

3次,每次1h,并在冲洗液中过夜,用1g・L琼脂包埋沉淀

细胞,用1g・L水,100g・L

-1

锇酸后固定2h,冲洗后,用梯度丙酮系列脱

丙酮与包埋剂(1∶1)混合物37℃浸透3h,

a,thecontrol:thechromatinevenlydistributedandstainedregularly;b,VP16treated:thecondensationandmarginationofthechromatinonnuclearmembraneinthepresenceofVPfor4h;c,NaN3treated:thedegradationandbrokenpiecesofcellchromatin.

图2　Hoechst33258染色荧光显微镜观察HL260细胞凋亡和坏死

Figure2　HL260apoptosisandnecrosisinfluorescentmicroscopestainedbyHoechst33258

2.3　细胞凋亡的荧光显微镜动态及定量检测核形态比例开始变化,出现核浓缩细胞,比例在处理8h达高峰,然后下降;而核碎裂细胞的比例在24h达高峰约占

80%。表明核浓缩发生在核碎裂之前。在整个培养过程中,VP16处理者,具有坏死细胞核形态特点的细胞少于8%。

荧光显微镜以核碎裂、核浓缩为凋亡特征,核弥散为坏死特征,对VP216诱导的HL260细胞凋亡和NaN3诱导的细胞坏死进行了动态及定量分析。如图示:VP216处理4h后,

王盛兰,等　电镜和荧光显微技术在细胞凋亡研究中的应用・93・

观察可以发现细胞核及染色质的这些变化,从而识别细胞凋亡。本文在荧光显微镜下可很好地显示出正常细胞与凋亡细胞或坏死细胞的核的差异,正常细胞核形态规整、染色均匀;而凋亡细胞呈明显的核浓缩及碎裂,在透射电镜下细胞染色质浓缩、核周边集呈块状或新月形,或有核碎裂,而胞膜完整,线粒体形态正常,符合凋亡的形态特征[3];荧光显微镜下,坏死细胞弥散,而无凋亡时染色质凝聚及碎裂现象,电镜下坏死细胞的细胞膜及核膜破裂,线粒体肿胀,染色质絮状散在,符合细胞坏死的特征[4]。

在凋亡诱导过程的不同时间点动态观察细胞核形态变化,处理后4h核形态开始变化,有核浓缩的细胞比例在处理的8h达高峰,然后下降,核碎裂细胞的比例在24h达高峰,约占80%,表明核浓缩发生在核碎裂之前,这与凋亡发生过程一致;而坏死细胞则为核溶解的过程;因此,荧光显微镜可动态观察细胞凋亡的变化。研究表明:应用荧光显微镜技术能很好地客观反映细胞凋亡,不仅可做凋亡的定性研究,并可进行定量研究和动态观察,且方法简便,是良好的凋亡检测手段。参考文献

1ArendsMJ,MorrisRG,WyllieAH.Apoptosis:theroleoftheen2donuclease[J].AmJPathol,1990,136:5932608

2HallPA.Assessingapoptosis:acriticalsurvey[J].JEndocrRelatCancer,1999,6(1):328

3MelcherA,GoughM,TodrykS,etal.Apoptosisornecrosisfortumorimmunotherapy:what’sinaname[J]?JMolMed,1999,77(12):8242833

4武忠弼.病理学[M]1第4版,北京:人民卫生出版社,1998124233

(2002203212收稿)

未经处理的对照组细胞,在整个培养过程中,各种核形态所占百分比的变化不大:85%～90%的细胞核规整且呈圆形,

5%有核碎裂,4%～9%有核浓缩,1%细胞核呈不规则形状。

而用NaN3处理后的细胞,具有核溶解或弥散特征的坏死细胞的比例在2～24h渐渐从5%升高到97%,但核碎裂及核浓缩细胞的比例不超过对照组(图3)。

图3　VP19和NaN3诱导HL260细胞凋亡和坏死的比例变化Figure3　ThequantitativechangeofHL260apoptosisandnecrosisinducedbyVP16andNaN3

3　讨论

对细胞凋亡的检测,主要有以下几种方法:电镜观察、荧光及普通光学显微镜观察、DNA电泳、流式细胞术、TUNEL原位DNA断片化分析以及凋亡过程蛋白因子、酶活性检测等[2]。而大多数形态学的方法不能动态和定量检测细胞凋亡,或实验周期长,如电镜;生化的方法无法反映形态的改变。细胞凋亡的形态改变主要为细胞核的变化,即细胞染色质浓缩,并边集于核膜,随后出现核碎裂和凋亡小体的形成。因此,通过电子显微镜或亲DNA荧光色素染色,荧光显微镜

(本文编辑:景　霞)

《北京大学学报(医学版)》2003年第3期“神经科学重点号”征稿启事

　　《北京大学学报(医学版)》2003年第3期(2003年6月出版)为“神经科学重点号”,欢迎踊跃投稿。稿件经专业审稿和编委定稿会确定采用后即可在该期刊出。稿件撰写要求与投稿注意事项见本期“《北京大学学报(医学版)》稿约”。投稿时请附单位介绍信,交稿件一式二份,并在稿件首页左上角注明“神经科学重点号征文”。本次征稿截止时间为2003年3月25日。

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