RD细胞培养操作细则
1.目的
根据世界卫生组织脊髓灰质炎病毒检验手册，对RD细胞培养作必要的细化和补充，以规范本中心对RD细胞培养的操作方法。
2.适用范围
本操作细则适用于RD细胞培养。
3.职责
检测人员：负责按照本操作细则对RD细胞进行传代培养。
复核人员：负责对RD细胞进行传代培养操作是否规范及细胞生长状态进行复核。
科室负责人：负责对科室综合管理。
4．方法原理
RD细胞培养采用胰酶与PBS联合应用消化细胞，分瓶/管传代。
5.检验依据
5.1《内蒙古自治区疾病预防控制中心质量管理手册》
6．细胞状态
RD细胞已生长良好，并已长成单层。
7．设备和材料或试剂
CO2培养箱、倒置显微镜、0.25%胰酶、PBS、生长液、培养瓶、吹打管。
8．细胞培养条件
温度36.5℃，CO2浓度5%。
9．操作步骤
打开瓶盖，倒去培养液
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加入5mlPBS，轻摇三次，倒去PBS
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加入3mlPBS和1ml0.25%胰酶，覆盖细胞层
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平放于36.5℃温箱，作用约1~2分钟，
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倒去消化液，细胞面朝上，置36.5℃温箱约5分钟
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轻振或拍打细胞瓶，使细胞自瓶壁完全脱落成悬浮状态
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加入40~50ml生长液，用吹打管沿瓶壁吹打，使细胞充分混匀
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用吸管吸出细胞悬液分装成每瓶10ml（即1:4或1:5传代）
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用不脱色的记号笔作好标记（RD、代数、传代日期）
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平放于36.5℃温箱培养（一般三天左右长成单层）
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做好细胞传代记录
10．细胞生长状态观察
于RD细胞传代第二天，将细胞瓶置倒置显微镜上，观察其生长状态，并做好记录。
11．支持性文件
WHO：脊髓灰质炎病毒检验手册
12．质量记录
12.1仪器设备使用登记表
12.2细胞传代记录
13．附录
附录A 细胞传代、冻存、复苏记录表
14．操作注意事项
14.1细胞传代操作应于实验室的干净区进行。
14.2严格的无菌操作。
14.3不同种类细胞使用同一超净台时，应在做完一种细胞后，经紫外线消毒后再进行另一种细胞的传代。
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