啤酒酵母残渣提取甘露聚糖的研究

乏婴蹦　膨　　型巴氏杀菌监测仪　：８１１０＿　８４６Ｏｏ｛嚣｝８４ｆ６机０　１。１１０３。　嚣２　Ｂ６Ｍ　’　Ｅ－ｒｎａｉ　Ｆ：（ｔｎｇ￣ｂｒｃ－ｃｈｉｎａ∞ｆｎ　施阗颐贝隆舟　中嘲也＾’甲　颐贝隆电子科技（北京）有限公司　・１９・　［摘要］本文以废啤酒酵母制备生物蛋白质的剩残余物为材料，经甲醇、乙醇、丙酮以及费　林试剂络合法提纯，制取粉末状甘露聚糖。本文研究了化学方法制取甘露聚糖的工艺条件。　为食品发酵工业废弃物的综合利用以及环境保护开辟了一条新途径。　［关键词］啤酒酵母残渣提取甘露聚糖研究　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｎｎｏｓｅ　Ｕｓｉｎｇ　Ｄｉｓｃａｒｄｅｄ　Ｂｅｅｒ　Ｙｅａｓｔ　ａｆｔｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　Ｄｕ　Ｄａｎ　Ｚｈａｏ　Ｃｈｕｎｙａｎ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｏｏｄ　ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１　１０１６１）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ｍａｎｎｏｓｅ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｂｅｅｒ　ｙｅａｓｔ　ｄｒｅｇｓ　ｗｈｉｃｈ　Ｃａｌｎｅ　ｆｒｏｍ　ｄｉｓｃａｒｄｅｄ　ｂｅｅｒ　ｙｅａｓｔ　ａｆｔｅｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ　Ｗａｓ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ　ｂｙ　ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｅｔｈａｎｏｌ　ａｎｄ　Ｆｅｈｌｉｎｇ’Ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｅｔｃ．　Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｍａｎｎｏｓｅ　ｂｙ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｌｃｈ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｅ　ｉｆｅｌｄ　ｏｆ　ｉｎｄｕｓｔｒｙ　ｗａｓｔｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｕｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｄｉｓｃａ，ｘｔｅｄ　ｂｅｅｒ　ｙｅａｓｔ　ｄｒｅｇｓ，ｅｘｔｒａｃｔ，ｍａｎｎｏｓｅ，ｒｅｓｅａｒｃｈ　酵母甘露聚糖是酵母细胞壁多糖中的一种　糖蛋白，分子量约在９万道尔顿左右，纯品为白色　１．２．１　粗蛋白含量测定：采用凯氏定氮法测　定［　］；　粉状固体，无毒、无异味，溶于水，溶液有黏性。　从废啤酒酵母中提取甘露聚糖是解决啤酒工业　污染，变废为宝的有效措施。国外市场每克酵母　甘露聚糖售价７０美元左右，国内市场没有国产商　品出售。　１．２．２甘露糖含量测定：紫外分光光度法＿８　；　１．２．３多糖含量测定：苯酚一硫酸法＿ｌ刮；　１．２．４测得甘露聚糖相对纯度按下式计算：Ｐ＝　测得甘露聚糖总量（ｇ）／提取物质量（ｇ）×１００％；　１．２．５　甘露聚糖纯度鉴定的方法：薄层层析　法［　。　废啤酒酵母提取生物蛋白质后的残余物，主　要为破碎的酵母细胞壁，其中含有大量的甘露聚　糖。本研究以提取生物蛋白质后的废啤酒酵母　１．３甘露聚糖提取方法　１．３．１粗多糖的提取：啤酒酵母残渣用ＫＯＨ溶　残渣为原料，经甲醇、乙醇或者丙酮等极性溶液　浸泡、提取、分离，制取粉末状甘露聚糖。　１材料和方法　液萃取，冷却后调ｐＨ为中性，经离心，将上清液　减压浓缩，加入４倍体积甲醇并搅拌过夜。将溶　液离心，收获沉淀，用甲醇、丙酮分别洗涤，风　ｆ：，　至此获得粗多糖。　１．３．２甘露聚糖的纯化：上述方法获得的粗多糖　１．１试验材料　酵母残渣：啤酒厂废啤酒酵母提取生物蛋白　质后的残余物。　１．２参数测定方法　收稿日期：２００６—０３—２７　尚含有一定量的葡聚搪、杂蛋白、色素等残留物　质。本实验选择费林试剂络合法　与酸碱法ｌｌＩ　ｌ做比较，对酵母甘露聚糖进行纯化。　审　维普资讯 http://www.cqvip.com

乏　・肘　腓　薪型巴氏杀菌监测仪　８１１ｏ＿０－８４０ｅ０ｍ１３５６　４ｍ６０１　ｍ１０　搿嚣｝　。。　’　（北京）有限公司　Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｎｏ＠ｅｂｒｏ￣￣ｉｎａ田　地Ⅲ　而贝隆　∞十闻甚　理　２Ｏ・　颐贝隆电子科技费林试剂络合法：取粗多糖用少许蒸馏水悬　浮并搅拌至溶解，加热，使不溶物析出，冷却后离　心去沉淀。上清液加入等体积费林溶液，获得沉　淀物，压碎沉淀至粉末状。加入ＫＯＨ溶液，搅拌　后离心，沉淀再用甲醇洗涤。沉淀用去离子水悬　浮，加入Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲ一１２０离子交换树脂，在磁力　搅拌器上强烈搅拌。过滤去除离子交换树脂，减　压浓缩后加入甲醇中，加浓盐酸１～２滴搅拌至生　成白色沉淀。离心收获沉淀，并用甲醇，丙酮洗　涤后风　至此获得白色粉末状精制甘露糖。　２结果与分析　２．１酵母泥与酵母残渣中各组分含量的比较　从（图１）可知，同未经提取蛋白质的酵母泥相　比，酵母残渣中总糖所占的比例增加，４３．４％；蛋　白质减少了４５．２％；甘露聚糖增加了４７．９％。总糖　和甘露聚糖所占比例的屁著升高，更有利于以自溶　残渣为原料来进一步分离甘露聚糖。　匝亟　Ｅ互巫固　图１　酵母泥及酵母残渣中各组分含量　２．２粗多糖提取条件的确定　碱液萃取是提取工艺中关键的工序。萃取　溶液ＫＯＨ浓度及萃取温度、时间对产品的得率及　纯度至关重要。设计正交试验设计，考察萃取溶　液的浓度、萃取温度和萃取时间三因素对萃取率　的影响。试验结果见（表１）。　通过极差分析得出，萃取温度对萃取率影响　最为显著，ＫＯＨ浓度的影响较显著，萃取时间的　影响作用很小。但如果萃取时间过长，多糖会发　生降解，而且杂质增多。根据以｝二分析结果及考　虑各种工艺因素，确定粗多糖萃取的最优工艺条　件为：萃取温度１００ｏｃ，ＫＯＨ浓度２％，萃取时间为　２ｈ。本文采用该组合条件进行了萃取试验，在此　条件下粗多糖的萃取率可达７６．９ｇ粗多糖／１００ｇ　酵母残渣，与正交试验中的最高萃取率一致。　２．３　中和用酸的种类选择　经碱萃取后，分别用盐酸、硫酸、醋酸（浓度均　为２０％）中和至ｐＨ６～７。这是因为酸或碱都可能　引起多糖降解或发生结构的变化，要尽量避免过酸　或过碱的环境，所以，碱浸提结束后要及时用酸中　和；而且中和还可进一步去除腔状物等杂质。如　（表２）所示，盐酸、硫酸与醋酸，前两者离心难度较　大，其酸性更强，更易使多糖发生酸水解；而且，醋　酸与ＫＯＨ反应生成的醋酸钾在甲醇中溶解度较　大，因而用甲醇沉淀得到的多糖中杂质盐含量少，　产品纯度更高。选择醋酸为中和用酸。　表１　莘取条件正交试验结果　因素与水平　萃取率　编号　ＫＯＨ浓度　温度　时问　误差　（％）　（％）　（ｃＣ）　（ｈ）　ｌ　ｌ　６ｏ　ｌ　１　６３．２　２　１　８０　２　２　７１．４　３　ｌ　１００　３　３　７２．７　４　２　６０　２　３　６８，８　５　２　８０　３　ｌ　７６．８　６　２　ｌ０Ｏ　１　２　７５．６　７　３　６０　３　２　６８．４　８　３　８０　１　３　７０．３　９　３　ｌ０Ｏ　２　ｌ　７２．Ｏ　Ｋ。Ｊ　２０７．３　２０ｏ．４　２ｏ９．１　２１２，Ｏ　Ｔ＝６３９，２　Ｋ　２＿　２２１．２　２１８．５　２１２，２　２１５，４　Ｘ：７１．０　．　２１Ｏ．７　２加．３　２１７．９　２ｌ１，８　Ｑｊ　４５４３２．４　４５４７８．２　４５４１０．７　４５４０ｏ．１　气　３５．Ｏ　８Ｏ．８　１３．２　２．７　Ｐ：４５３９７．４　表２中和用酸的选择　酸种类　离心时间／Ｉｌｌｉｎ（４００ｏｒｐｍ）　上清液　２ｏ％盐酸　１５　浑浊　２０％硫酸　ｌ５　浑浊　２０％醋酸　ｌ０　澄清　２．３多糖的物理性质　从ｌＯＯｇ啤酒酵母残渣里提取的粗多糖为　７Ｏ．１ｇ，是一灰色粉末，较易溶于水，溶液无色透　明，ｐＨ值为６．５。不溶于乙醇、乙醚、丙酮。　２．５费林溶液络合条件的确定　由甘露糖组成的甘露聚糖，在特定反应条件　下（温度、时问等），可以和费林氏溶液形成络合　物，发生沉淀，从而达到分离的目的。（图２）为改　变温度条件在不同时问获得的络合物沉淀，可以　确定在低温４℃条件下１２ｈ可以更好地获得络合　物沉淀。络合物用碱、甲醇溶液抽提，利用离子　维普资讯 http://www.cqvip.com

申通，■团ｇ　６】Ｃ　ＪＥ　（液志、蚓６界）　拓璞∞２　税　｛Ｉ｝　玉门拓璞科技开发有限责任公司出品　・２１　・　交换树脂除去无机盐类，即可以分离出所需的甘　露聚糖纯品。　１００　８（）　芝６ｏ　４Ｏ　２Ｏ　０　（Ｉ１）　图２络合温度和时间对络合物得率的影响　２．６不同分离方法对甘露聚糖纯化效果的影响　纯化后的多糖经薄层层析法鉴定（见图３），　发现络合法提纯后的多糖中只含有甘露糖，并通　过薄层扫描仪检测甘露糖占多糖含量的９８．３％，　表明多糖的糖链主要由甘露糖组成。由此可知，　纯化后的甘露聚糖样品中，已不含有葡聚糖，即　费林试剂络合法可以除去葡聚糖，达到分离纯化　甘露聚糖的目的。　Ｍ：单糖的混合标　准样品，按Ｒｆ的从小　到火分别为半乳糖、　葡萄糖、甘露糖、木糖　和鼠李糖；　１：络合法提取的　多糖样品；　２：酸碱法提取的　多糖样品。　图３最终提取物单糖组成的薄层层析鉴定　表３两种提纯甘嚣聚糖方法的比较　项目　提纯方法　酸碱法　络合法　甘露聚糖得率（％）　３１．８　３６．２　蛋白质含量（％）　１．６　０．７　甘露聚糖成分　甘露聚糖、葡聚糖　甘露聚糖　通过（表３）两种不同提纯甘露聚糖方法的比　较，选用费林试剂和离子交换树脂相结合的方法来　纯化甘露聚糖是可行的，费林试剂络合法具有简　便、快速、选择性强及处理样品量大等优点。离子　交换树脂具有除盐效果好和易于操作等优点，二者　相结合，可得到纯度高的均一性甘露聚糖。经薄层　层析法鉴定，所得样品纯度达到化学结构分析的要　求，可用于甘露聚糖结构分析研究。　２．７甘露聚糖物理性质　白色粉状固体，无毒、无异味，溶于水，溶液　有黏性。ｐＨ值为６．５。　３结论　３．１本文研究了碱溶液萃取法提取啤酒酵母残　渣中的粗多糖。由于酸度、温度和时间等操作条　件易于控制，因此该方法具有广泛的适用性。　３．２获得的粗多糖利用费林试剂络合，经碱液和　甲醇抽提，通过离子交换树脂法除盐，获得了纯　度达到９８．３％的甘露聚糖纯品。结果表明，利用　此种方法提取啤酒酵母残渣中的甘露聚糖是成　功的。　３．３从经济效益来看，通过从废啤酒酵母提取生　物蛋白质，而后的残渣再利用制取甘露聚糖，提高　了废啤酒酵母综合利用的附加值。啤酒酵母细胞　壁中的甘露聚糖用途广泛，且成本低廉，操作简便，　是废啤酒酵母开发利用的一条很好途径。　参考文献　［１］Ｌｉｐｋｅ　Ｐ　Ｎ，Ｏｖａｌｌｅ　Ｒ．Ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ：ｌｌｅＷ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｈｅｗ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｊ　Ｂ￣ｔｅｒｉａ１．１９９８，１８０（１５）：３７３５～３７４０．　［２］王方凌．啤洒酵母与健康．【乇春Ｈ｛版社，１９９５．　［３］周义发，张翼伸，梁忠岩，等．酵母甘群聚糖的结构确定　核磁　共振谱的解析．生物化学杂志，１９９１，７：７４～７８　［４］江萍，王义华，周碧君，等．三种酵母胞壁多糖的化学组成及血　清学试验．食品科学，１９９９，９：４８—５１．　［５］陆冰真，翟永信．薄层层析法在食品分析中的应用．北京大学　版社．１９９１．６一舳．　［６］Ｏｓｕｍｉ　Ｍ．Ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｔｍｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｙｅａａｔ：ｃｄｌ　ｗａｌｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｏｎｎａ－　ｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｎ。１９９８，２９：２０７～２３３．　［７］Ｄｏｍｅｒ　Ｊ　Ｅ．Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｅｌｌ　ｗａｌｌⅫ衄肌：ａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｗｉｔｈ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８９，１７（１）：３３～５１．　［８］张运涛，谷文英．紫外分光光度法测定啤酒酵母ｒＩＩ甘露糖．食　品与发酵工业，１９９９。５：２６～２８．　［９］张惟杰．糖复合物生化研究技术．浙江大学出版社，１９９４　［１Ｏ］诸葛健．现代发酵微生物实验技术．北京：化学－Ｆ．ｑ＿ｋ出版社，　２００５　［１１　Ｊ孙建义，李卫芬．啤酒酵母甘露聚糖的提取及其对鸡肠道微　生物区系的影响．浙江大学学报，２００１，２７（４）：４４７—４５０　［１２］高孔荣等．食品分离技术，广州：华南理Ｔ．大学出版丰十，１９９８　［１３］李凡，啤酒酵母胞壁多糖对免疫细胞功能的影响（Ｊ）．自求恩　医科大学学报，１９９８，２４（２）：１２４～１２５　［１４］阚建全，陈宗道等．啤酒酵母胞壁多糖抑制肿瘤作用的实验　研究．中国食品学报．２００３，４：５～９　［１５　３周义发，梁忠岩．酵母甘露聚糖的研究．东北师大学报自然科　学版．１９９１，２：７９～８２　［１６］食品分析［Ｍ］．北京：叶１国轻丁业出版社，２００２．２３５—２３７．　［１７］何照范，张迪清编著．保健食品化学及其检测技术．北京：　ｆＩ　国轻工业出版社，１９９８．　［１８］冯学民等．试验与统计．哈尔滨１程大学出版社，２００２．