康宁木霉诱变菌株产酶条件的研究

康宁木霉诱变菌株产酶条件的研究　刁彩霞，甘文平，麻名汉　（黑龙江省农垦科学院畜牧特产所，哈尔滨１５００３８）　摘要：试验以稻草为主要碳源，采用物理和化学诱变相结合的方法对康宁木霉进行选育，发现康氏木霉ｊ　产酶能力最强，并初步研究了康氏木霉ｊＳ４的产酶条件。　关键词：康宁木霉；产酶　。　。一　。　、　中图分类号：Ｑ９２５文献标志码：Ａ文章编号秘ｔ０ｏｉ￣８４（２　ｌ０）１２－０００１．０４　纤维素是地球上数量最大的可再生资源，微生　三角瓶培养基：黑曲霉：稻草粉５０　ｇ・Ｌ一、麦　物对其降解、转化是自然界中碳元素转化的主要环　麸１０　ｇ‘Ｌ～、（ＮＨ４）２Ｓ０４　１０　ｇ・Ｌ～、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０　０．５　节。纤维素的生物转化与利用对解决当前世界能源　ｇ・Ｌ～。康氏木霉培养基中含稻草粉５０　ｇ・Ｌ～、麦麸　危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要意义。　１０　ｇ・ｌ『　、牛肉蛋白胨５　ｇ・Ｌ　、起始ｐＨ　５．０。　近年来，我国对纤维分解菌的应用研究十分活跃，　诱变初筛培养基：ＣＭＣ—Ｎａ　２　ｇ・Ｌ『　，牛肉蛋白　已筛选出具有独特的纤维素分解作用的高产菌株，　胨５　ｇ・Ｌ～，琼脂１４　ｇ・Ｌ　，刚果红０．２　ｇ・Ｌ～，脱氧　其在长期保存新鲜秸秆营养成分的同时，可降低纤　胆酸钠１０　ｇ・　，ｐＨ　５．０。　维素、半纤维素、木质素的含量，不仅适口性好，　１．２试验方法　保存期长，而且操作简便，成本低，为粮食主产区　将黑曲霉和康宁木霉菌种接种于斜面培养基　发展畜牧业提供了广阔的饲料资源　Ｊ。　上，２８℃培养４～６　ｄ后使用或在４℃下保存，　为此，本研究小组开展了混合菌株在东北地区　２５０　ｍＬ三角瓶装发酵培养基５０　ｍＬ，１２１℃灭菌　主要农作物玉米秸秆和稻草上的应用研究，本文主　２０　ｍｉｎ，接种用生理盐水冲洗的孢子１　ｍＬ（孢子数　要对２株产纤维素酶较高的黑曲霉菌株和康宁木　１０　个・ｍＬ　），２８℃在１２０　ｒｐｍ摇床上振荡培养　霉菌株进行了产酶效果的比较研究，并进一步摸索　１６８　ｈ，离心上清液即为粗纤维素酶液。　了培养条件。　ｐＨ用酸度计测定。纤维素、半纤维素和木质　１材料与方法　素的测定参考王建兵的方法　。残余还原糖的测定　１．１试验材料　采用ＤＮＳ法。　试剂：水杨素、羧甲基纤维素钠；试验中所用　酶活力的测定采用ＣＭＣ酶活性测定方法，取　其他试剂均为分析纯。　适当稀释的酶液０．５　ｍＬ，加入１％的ＣＭＣ溶液（溶　菌种及培养基：黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｔｕｓ　ｎｉｇｅｒ）ｊｇｌ、　于ｐＨ　４．８的０．１　ｔｏｏｌ・Ｌ～ＨＡｃ—ＮａＡｃ缓冲液中）１　ｍＬ，　康宁木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ）ｊｇ２由本研究室保　５０℃保温３０　ｒａｉｎ，加入ＤＮＳ试剂３　ｍＬ，沸水浴　藏。　５　ｒａｉｎ，冷却后加水稀释到２５　ｍＬ，在５２０／ｌｔ１ＴＩ处测　斜面培养基：黑曲霉ｉｇ１采用ＰＤＡ培养基，　还原糖。滤纸酶活力的测定：取适当稀释的酶液　康宁木霉ｉｇ２采用麦芽汁琼脂培养基。　０．５　ｍＬ，加入缓冲液（ｐＨ　４．８的０．１　ｔｏｏｌ・Ｌ～ＨＡｃ—　ＮａＡｃ）１　ｍＬ中，并加入１条ｌｘ６　Ｃ１ＴＩ的滤纸，５００　ｏＣ　收稿日期：２０１０—１０～１８　基金项目：功能性饲料及粗饲料高效利用关键技术研究（ＧＡ０７　保温１　ｈ，加入ＤＮＳ试剂３　ｍＬ，沸水浴５　ｒａｉｎ，冷　Ｂ２０１）　却后加水稀释到２５　ｍＬ，在５２０　ｎｍ处测还原糖。　作者简介：刁彩霞（１９７７一），女，山东诸城人，硕士研究生，　葡萄糖苷酶活力测定：取适当稀释的酶液０．５　ｍＬ，　主要从事微生态制剂在畜牧业方面的应用工作。　加入１　ｍＬ质量分数为１％的水杨素溶液（溶于ｐＨ　２０１０年第１２期饲料博览・技术版　１　４．８的Ｏ．１　ｔｏｏｌ・Ｌ～ＨＡｃ—ＮａＡｃ缓冲液中）。５０℃保　２结果与分析　温３０　ｒａｉｎ，再加入ＤＮＳ试剂３　ｍＬ，沸水浴５　ｒａｉｎ，　２．１　受试菌种产纤维素酶能力的比较　冷却后加水稀释到２５　ｍＬ，在５２０　ｎｍ处测还原　以秸秆为主要碳源，对受试菌种三角瓶产纤维　糖。　素酶的水平进行了反复比较，结果见表１。　表１受试菌种产酶能力的比较　菌种残余还原　督，ｍｇ‘箍Ｌ『　囊　ｃＭｃｃａｓｅ　舔　譬　滤纸酶活力厂Ｕ　ｔｍ　ｌ　ｌ葡萄糖苷酶活力，ｕ・ｍ　黑曲霉ｊｇｌ　０．３０１２　。。　。０００　曩Ｑ　．５　㈡一㈡　　－一２５．２４　≯　ｌ５２．４　ｌ　Ｉ康宁木霉ｊｇ２　０　一　０，２０４２－　≯　曩　２ｇ８＿２　““　一　３１．２６　曩　。０　１３．２　由表１可见，康宁木霉ｊｇ２产酶较高，残余还　表２康宁木霉ｊｇ２经诱变后产酶能力的变化　原糖较少，故选用康宁木霉ｊｇ２进行后续研究。　２．２康宁木霉　ｇ２诱变前后产酶能力的比较　为了提高康宁木霉产纤维素酶的能力，对其　进行了紫外线和硫酸二乙酯（ＤＥＳ）复合诱变，经　初筛、复筛获得了诱变菌株ｉｇ４，其产酶能力情况　见表２。　２．３不同碳源对康宁木霉ｉｇ４产酶的影响　由表２可见，经诱变后各组分均有一定程度的　分别以稻草粉、秸秆粉、麦麸（均过８０目筛）　提高，由硫酸二乙酯诱变后的菌种为康宁木霉ｉ　，　取代发酵培养基中的碳源，研究了碳源对产酶的影　在麦芽汁琼脂培养基上传代５次，每代进行发酵酶　响，结果见表３。　活力测定，发现产酶能力没有大的变化，说明其遗　由表３可见，康宁木霉．　４以稻草为碳源的酶　传稳定性较好，故以此菌种进行后续试验。　活力最高，其次是秸秆，麦麸最低。　表３不同碳源对康宁木霉ｊｇ４产酶的影响　２．４不同氮源对康宁木霉ｊｇ４产酶的影响　响优于有机氮，氨态氮优于硝态氮，（ＮＨ）４ＳＯ　为氮　选取常用的氮源：豆饼、蛋白胨、（ＮＨ　）　ＳＯ　、　源时ＣＭＣＣａｓｅ、滤纸酶、　一葡萄糖苷酶活力皆最　（ＮＨ　）　ＨＰＯ　、尿素为研究因素，比较不同氮源对康　高，残余还原糖量也处于较低的水平，这一结果与　宁木霉ｊｇ４产酶的影响，结果见表４。　李爱华等的试验结果一致…］。因此，本研究选用　由表４可见，无机氮对康宁木霉ｊｇ４产酶的影　（ＮＨ）４ＳＯ　作为氮源。　表４不同氮源对康宁木霉ｊｇ４产酶的影响　２　饲料博览・技术版２０１０年第１２期　２．５通气量对康宁木霉ｊｇ４产酶的影响　基均能获得较佳的产酶效果，但随着装液量的继续　２５０　ｍＬ三角瓶装填不同体积的培养基，进行　增加，产酶水平逐渐下降，这可能是由于供氧不　产酶试验，结果见表５。　足，不利于康宁木霉的生长。本试验选择了４０　ｍＬ　由表５可见，２５０　ｍＬ三角瓶装３０～６０　ｍＬ培养　培养基。　表５通气量对康宁木霉ｊｇ４产酶的影响　２．６培养温度对康宁木霉ｊ　产酶的影响　从表６可见，３０℃产酶水平最高，较低温度　培养温度对康宁木霉ｊｇ４产酶也有很大的影响，　对康宁木霉ｊ　产酶不利，可能是因为较低温度会　本研究选择了不同温度进行发酵试验，结果见表６。　影响菌丝体的生长。　表６培养温度对康宁木霉ｊｇ４产酶的影响　２．７接种量对康宁木霉ｉｇ４产酶的影响　稻草２．４　ｇ，麦麸１．２　ｇ，（ＮＨ　）２Ｓ０　１％，装液量４０　ｍＬ，　试验用孢子悬浮液，孢子为麦芽汁琼脂斜面培　转速１４０　ｒｐｍ，培养温度３０　，每１２　ｈ取１次　养４－６　ｄ后，用生理盐水充分冲洗得到，用不同体　样，研究残余还原糖及纤维素酶活力的变化，结果　积的孢子悬浮液接种见表７。　见图１、２。　由表７可见，接种量对产酶影响不大，本研究　从图１可见，在发酵过程中，由于菌体生长消　选择接种２　ｍＬ抱子悬浮液、３０　ｍＬ发酵培养基。　耗，残余还原糖先下降，随后上升，说明康宁木霉　２．８培养时间对康宁木霉ｉ　产酶的影响　产生了水解酶，将麦麸和稻草粉降解为还原糖，但　根据上述试验结果，选择ｊ角瓶发酵培养基：　随着发酵的进行，还原糖会逐渐被菌体消耗而下降。　表７接种量对康宁木霉ｊｇ４产酶的影响　２０１０年第１２期饲料博览・技术版　３　２　Ⅲ／ｌ　卿避　Ｏ　５　２　５　ｌ　—ｂ　０　０　１２　２４　３６　４８　６０　７２　８４　９６　１Ｏ８　１２Ｏ　ｌ３２　ｌ４４　时间，ｈ　图１摇瓶发酵过程中残余还原糖变化　＋口一葡萄糖苷酶＋ＦＰＡ＋ＣＭＣａｓｅ　７０　６０Ｏ　｛６０　５００　：蠢５０　４００　羹　。　３００　婶３０　誓２０　】。　ｏｏ吞　＿寸］　　］　］１０　１００　Ｏ　０　Ｏ　１２　２４　３６　４８　６０　７２　８４　９６　ｌ０８　１２０　１３２　ｌ４４　１６８　时间／｝ｌ　图２摇瓶发酵过程中ＦＰＡ，卢一葡萄糖苷酶，ＣＭＣ酶活力的变化　从图２可见，康宁木霉ｉｇ４发酵过程中ＣＭＣ酶　ｃｕｌａｎｔｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｃｏｒｎ　ｓｉｌａｇｅ　ｆｏｒｌａｅｔａｔｉｎｇ　ｄａｉｒｙ　活曲线有两个峰值，３６　ｈ时ＣＭＣ酶活力出现第１　ｃｏｗｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｄａｉｙｒ　Ｓｃｉ，１９９３，７６（１２）：３　７６３—３　７７０．　个高峰，酶活力达８０．４５　Ｕ・ｍＬ～，随后缓慢下降，　Ｓｔｏｋｅｓ　Ｍ　Ｒ，Ｃｈｅｎ　Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ－ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｎ　其最高峰值出现在１３２　ｈ，随后缓慢下降；滤纸酶　ｔｈｅ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｉｎ　ｓｉｌａｇｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｄａｉｙｒ　Ｓｃｉ，１９９４，７７　活力和Ｊ８一葡萄糖苷酶活力也在１３２　ｈ出现峰值。　（１１）：３　４０１—３　４０９．　３结论　李素波，孙智敏，周剑平，等．康宁木霉菌株的诱变选育及固态　本研究发现，培养基组成和培养条件对康宁木　发酵条件的优化『Ｊ１．中国酿造，２００８（１３）：３０—３３．　霉ｉｇ４产酶均有显著影响，当以稻草粉和秸秆为主　包衍，王晓辉，张伟琼，等．纤维素分解菌的选育及酶活测定　要碳源时，有利于康宁木霉ｉｇ４发酵产酶，这表明　ｌＪ１．生物学杂志，２００７，２４（２）：５６—５８．　其产酶为诱导酶，在试验中氮源选用硫酸铵较好，　吴胜莲，汪彬，周映华，等．纤维素降解菌群筛选与降解活性分　说明康宁木霉ｉｇ４利用无机氮的能力较强。试验表　析『Ｊ１．饲料博览，２０１０（３）：２４—２６．　明，康宁木霉ｉｇ４液体摇瓶发酵培养基为：稻草　鞠洪波，郎子健．食用菌对山杨木质素及纤维素的降解ｌ　Ｊ＿．东　粉５０　ｇ・　，麦麸１０　ｇ・　，硫酸铵１０　ｇ・Ｌ－ｘ，装液量　北林业大学学报，２００７，３５（１２）：４１—４２．　４０ｍＬ，ｐＨ自然。发酵条件为：培养温度３０℃，转　孙迅，任少亭，毕瑞明，等．粗毛栓菌降解麦草木质纤维素的试　数１２０　ｒｐｍ，培养时间为１３２　ｈ。　验研究『Ｊ１＿微生物学杂志，２００２，２２（１）：２４—２７．　范寰，梁军锋，赵润，等．碳氮比对复合木质素降解菌产酶活力　【参考文献１　和木质素降解能力的影ｌｌｌ￣［Ｊ］．中国饲料，２０１０（１４）：２３—２５．　王建兵，韩继福，高宏伟，等．微生物接种剂和酶制剂对玉米秸　［１］王立群，李秋玫，李杰，等．秸秆生物处理技术研究——微生物　秆发酵品质的影响ｆＪ１．内蒙古畜牧科学，２００１（２）：４－７．　生态组合及发酵因素优化『Ｊ１．黑龙江畜牧兽医，１９９９（１）：１８—１９．　李爱华，李耀忠，宋莉莉．紫外线诱变康宁木霉提高酶活力的　【２】Ｋｕｎｇ　Ｊｒ　Ｌ，Ｃｈｅｎ　Ｊ　Ｈ，Ｋｒｅｃｋ　Ｅ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｉｎｏ一　研究【Ｊ１，宁夏大学学报（自然科学版），２００３，２４（４）：３９０—３９１．　４　饲料博览‘技术版２０１０年第１２期　　＿卜］大蒜素对肉仔鸡生长性能及　免疫器官生长发育的影响　夏伦斌，徐良春　（皖西学院生物与制药工程学院仿生传感与检测技术省级实验室，安徽六安２３７０１２）　摘要：试验旨在探讨大蒜素对肉仔鸡生长性能及免疫器官生长发育的影响，选用１日龄雏鸡３６０只，随机　分为３组　每组３个重复，每个重复４０只。分别为对照组、杆茵肽锌组（８０　ｍｇ．ｋｇ－１）和大蒜素．￣ｇ（６５０　ｍｇ＂ｋｇ－１）。　结果表明，大蒜素组和杆菌肽锌组与对照组相比，全期平均辩增重分别提高７：０５％和７．４８％（Ｐ＜０．０５）；料肉比分别　降低１０．２０％和９．６９％（Ｐ＜０．０５）；大蒜素组与对照组相比，法氏囊、脾脏、胸腹指数均有不同程度的提高，且差异　显著（Ｐ＜Ｏ．０５）。　关键词：大蒜素；肉仔鸡；生产性能；免疫器官　中图分类号：￥８３１；￥８１６．７文献标志码：Ａ文章编号：１００１－００８４（２０１０）１２－０００５－０４　大蒜素（Ａｌｌｉｃｉｎ）是从百合科葱属植物大蒜的鳞　生产中的应用推广提供一定的参考数据。　茎中提取的生物活性物质。研究表明，大蒜素中含　１材料与方法　有多种活性物质，能使细胞代谢增强，促进动物机　１．１试验材料　体溶菌酶的大量释放，增强机体的非特异性免疫功　大蒜素购自北京昕大洋科技发展有限公司，有　能，抗肿瘤、促进淋巴细胞、巨噬细胞的增生，刺　效含量为２５％；杆菌肽锌购自天津市新星兽药厂，　激淋巴细胞分泌干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介　含杆菌肽锌１５％的颗粒。　素等【１１。本试验旨在进一步探讨大蒜素对肉鸡生长　１．２试验动物及日粮　性能及免疫器官生长发育的影响，为大蒜素在肉鸡　选用同批次人工孵化出的被毛干净、绒毛粗、　收稿日期：２０１０一ｌＯ一０８　干燥有光泽、体重均匀、腹部柔软、健壮的１日　作者简介：夏伦斌（１９７７一），男，安徽六安人，硕上，主要从　龄商品代雌雄混合雏鸡（江淮麻黄鸡３６０只）。基础　事动物科学和动物病原分子生物学方面的教学和研究Ｔ作。　日粮组成及营养水平见表１。　船些些出逝逝　鲁　妊　逝　－Ｎｅ窖妊　－Ｎｅ　章　船・逝　船船　船些　迎船始　些’姑　妇始　出　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　Ｋｏｎｉｎｇｉｉ　ＤＩＡＯ　Ｃａｉｘｉａ，ＧＡＮ　Ｗｅｎｐｉｎｇ，ＭＡ　Ｍｉｎｇｈａｎ　（Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｌａｎｄ　Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００３８，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｄｏｐｔｅｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｒｉｅｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ　ｊｇ４　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ，Ａ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ　ｊｇ４．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ；ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ　２０１０年第１２期饲料博览．技术版　５