基于NGS-SNP分型和IBS策略进行全同胞关系鉴定

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·论著·

基于NGS-SNP分型和IBS策略进行全同胞关系鉴定

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王致远1，，王迪佳3，李燃1，李海霞1，汪娜娜1，孙宏钰1

（1.中山大学中山医学院法医学系，广东广州510089；2.佛山市公安局，广东佛山528000；3.深圳市公安局龙华分局，广东深圳518109）摘

要：目的评估单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）分型结合状态一致性（identity

bystate，IBS）分析策略进行全同胞鉴定的效能。方法收集一个四代家系共35个成员的血样，采用Preci⁃sionIDIdentityPanel对90个常染色体SNP进行分型。统计并比较全同胞与其他亲缘关系IBS评分分布的差异，分别采用Fisher判别函数法和阈值法进行各种亲缘关系判定。结果基于家系和前期研究，分别获得全同胞、祖孙、叔侄（姨甥）、第一代堂表亲关系共44、30、111、71对以及无关个体1000对，平均IBS评分分别为148、130、132、124、120。除祖孙与叔侄（姨甥）关系外，其余关系之间的IBS评分差异均有统计学意义（P<0.05）。基于IBS评分建立的Fisher判别函数对于全同胞、祖孙、叔侄（姨甥）、第一代堂表亲关系的错判率分别为1.3%、22.3%、17.0%、38.7%。基于10000对模拟样本的IBS评分分布，推荐使用t1=128、t2=传标记可满足全同胞关系的鉴定要求，基于IBS评分的阈值法的错判率更低，使用更加灵活。关键词：法医遗传学；单核苷酸多态性；同胞关系；状态一致性；下一代测序中图分类号：DF795.2

文献标志码：A

141作为全同胞判定的IBS阈值（错判率≤0.05%）。结论PrecisionIDIdentityPanel包含的90个SNP遗

doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2019.02.014

文章编号：1004-5619（2019）02-0205-05

FullSiblingTestingBasedonNGS-SNPGenotypingMethodandIBSStrategy

WANGZhi-yuan1,2,WANGDi-jia3,LIRan1,LIHai-xia1,WANGNa-na1,SUNHong-yu2

（1.DepartmentofForensicMedicine,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510089,China;2.FoshanPublicSecurityBureau,Foshan528000,GuangdongProvince,China;3.Long⁃huaBranchofShenzhenPublicSecurityBureau,Shenzhen518109,GuangdongProvince,China）

Abstract：ObjectiveToevaluatetheeffectivenessofsinglenucleotidepolymorphism（SNP）genoty-pingincombinationwithidentitybystate（IBS）strategyinfullsiblingtesting.MethodsThirty-fivebloodsampleswerecollectedfromafour-generationfamily.NinetyautosomalSNPsweregenotypedusingPrecisionIDIdentityPanel.ThedistributionofIBSscoresforfullsiblingsandotherrelation-shipswerecalculatedandcompared.TherelationshipsweredeterminedusingFisherdiscriminantfunc-tionandthresholdmethod,respectively.ResultsBasedonfamilymembersandpreviousresearch,44,30,111,71and1000pairsoffullsiblings（FS）,grandparent-grandchild（GG）,uncle/aunt-nephew/niece（UN）,firstcousins（FC）andunrelatedindividuals（UI）wereobtained,respectively.TheaverageIBSscoreswere148,130,132,124and120,respectively.ExceptfortheGGandUNpairs,thedistri-butiondifferencesamongtheotherrelationshipshadstatisticalsignificance（P<0.05）.ThefalseratesofFisherdiscriminantfunctiontodeterminerelationshipswere1.3%,22.3%,17.0%and38.7%forFS,GG,UNandFC,respectively.Basedonthesimulationdata,thethresholdst1=128andt2=141wererecommendedtodeterminefullsiblingrelationships（thefalserate≤0.05%）.ConclusionThe90SNPgeneticmarkersincludedinthePrecisionIDIdentityPanelmeetthetestingrequirementsforfullsiblingrelationships.ThethresholdmethodbasedonIBShasarelativelylowerfalserateandismoreflexible.

Keywords：forensicgenetics;singlenucleotidepolymorphism;siblingrelations;identitybystate;nextgenerationsequencing

基金项目：国家自然科学基金面上资助项目（81671873）作者简介：王致远（1986—），男，硕士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：316439357@qq.com通信作者：孙宏钰，女，教授，博士研究生导师，主要从事法医物证学研究；E-mail：sunhongyu2002@163.com

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SNP片段短、）单核苷酸多态性具有突变率低数量丰富等特点，（仅为（single被称为第三代遗传标记STRnucleotide的十万分之一）polymorphism、扩增

，

[1-3]。但是，由于单个SNP位点通常只有两个等位基因，多态

性较STR相对低，因此要检测更多的SNP位点才能达到法医学个体识别和亲子鉴定的检测需求。SANCHEZ等[4-5]CE）技术开发了包含基于传统的毛细管电泳52个（SNPcapillary位点的electrophoresisSNPforID检测

，体系，研究结果显示，其可以应用于个体识别，但是仍然难以满足亲缘关系分析的要求。

quencing近年来，throughput，MPS大规模平行测序）技术，又称为（massively高parallelse⁃

generationsequencing步检测的遗传数目增多，sequencing，，HTS通量测序（high-NGS）检测成本降低）技术或下一代测序技术，发展迅速，（next[6-7]。本课题

能够同

Identity组前期基于PanelIon分TorrentTM型体系，平台的探索了HID-Ion90AmpliSeqTM

位点在广东汉族群体的多态性[8]，本研究拟基于状态个常染色体SNP

一致性SNP（identitybystate，IBS）分析策略，探索这90个

1

位点在全同胞关系分析中的效能。

1.1样本收集和材料与方法

在知情同意原则下，DNA提取

采集中国汉族一个四代家系

共35个成员的血样，个体之间关系如图1所示。使用

（美国AutoMateThermoExpressTMFisherForensicScientificDNA公司）Extraction提取DNASystem，Fisher

并使

Scientific用QubitTMdsDNAHSAssayKit（美国ThermoFisher课题组前期研究中的无关个体Scientific公司）在公司QubitTM）上进行3.0荧光定量仪DNASNP定量。另外，（美国Thermo分型数据[8]随机组根据本

合获得1000对无关个体（unrelatedindividual，UI）。

A1

A2

A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12A13A14A15A16A17A18A19

A20A21A22A23A24A25A26A27A28A29A30A31A32A33A34

A35A36

图1本研究对象的四代家系系谱图

A13个体未采样

1.2常染色体采用GoldenSTReye􀳏分型

DNA身份鉴定系统25A［基点认知技术（北京）公司］对23个常染色体STR基因座进行扩增，Scientific公司）在3500xL上进行检测，基因分析仪并使用（美国GeneMapper􀳏ThermoFisherID-

JournalofForensicMedicine,April2019,Vol.35,No.2

XSTRv1.5软件（美国ThermoFisherScientific公司）进行

1.3常染色体分型。

采用PrecisionSNP分型

IDIdentityPanel（美国Thermo（美国FisherThermoScientificFisher公司）Scientific和IonAmpliSeqTM公司）进行文库构建LibraryKit[8]。该检测体系可同时检测90个常染色体身份信息SNP（identityinformativeSNP，iiSNP）以及34个Y-SNP位点。扩增产物使用FisherIonChefTMSystem（美国Thermo520TM或ScientificIon530TM公司）进行自动化模板制备，应用Ion公司tific）在IonS5TMXLKitSystem（美（国美国ThermoThermoFisherFisherScientificv5.2.2公司）分析，软件上进行测序。测序结果采用同时结合（美国TorrentSuiteScien⁃TMHIDThermoSNPFisherGenotyperScientificPlugin公司）v4.3.1进行软件1.4（美国数据分析

ThermoFisherScientific公司）进行SNP分型。对于家系中的所有父-母-子关系，根据23个常染色体PI），依照行业技术规范STR的分型结果，计算亲权指数（paternityindex，[9]bined，如果累积亲权指数（com⁃间的亲子关系。基于该家系共获得全同胞paternityindex，CPI）大于10000，则支持他们之ling甥）（，FSuncle/aunt-nephew/niece）、祖孙（grandparent-grandchild（fullsib⁃，UN）和第，GG一）代、叔侄堂表（姨亲（firstcousin，FC）共4种亲缘关系类型。参考《生物学

全同胞鉴定实施规范》[10]

，分别计算各种关系类型的IBS评分，采用R语言绘制各关系类型的IBS分布图[11]。采用Wilcoxon秩和检验比较全同胞与其他亲缘关系类型20.0IBS软件建立各种关系的评分分布的差异，检验水准IBS评分作为判别因子Fisher判别函数α=0.05。采用SPSS[12]。以待鉴定个体对的（S），分别代入相应的判别函数获得判别评分L值，并将该对个体的关系类型归为L值较大的组别。同时，基于前期研究获得的频率数据[8]，分别模拟10000对4种亲缘关系和

无关个体样本对。参考《生物学全同胞关系鉴定实施规

范》[10]，对于待鉴定个体对，如果其IBS评分小于或等

于某一阈值（下限值t1或等于另一阈值（上限值），则判定为无关个体；t如果大于

2如果在t），则判定为对应亲缘关系；1和t2判率分别为≤0.01%之间，则无法判定。基于此设定探索错、≤0.05%、≤0.1%、≤0.5%和≤1%

时的判定阈值以及相应的系统效能。

2

2.1SNP结对于该家系的测序概况

果

35个样本共进行了3批测序，装载

法医学杂志2019年4月第35卷第2期

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型之间差异均有统计学意义（P<0.05）。

（chiploading）比例分别为62%、70%、73%，富集率（enrichment）分别为93%、95%、95%，单克隆（mono⁃

clonal）比例分别为64%、67%、67%，总计获得超过1400万条序列（reads）。35个样本在90个SNP位点

均获得完整分型，分型率为100%。

2.2家系成员关系确认

根据23个常染色体STR分型结果对本研究四代家系中所有的父-母-子关系进行了确认，基于该家系样本可获得的亲缘关系类型及数量如表1所示。

表1本研究四代家系样本的关系类型及数量关系类型全同胞祖孙叔侄（姨甥）第一代堂表亲合计

数量/对443011171256140

IBS120100

FS

GG

UN关系类型

FC

UI

2.3各类亲缘关系的IBS评分分布

基于该90个SNP分型结果，在256对亲缘关系中，全同胞的平均IBS评分最高（IBS=148），第一代堂表亲的平均IBS评分最低（IBS=124）。祖孙、叔侄（姨甥）的平均IBS分值分别为130、132。相比之下，无关个体的IBS评分最低，平均仅为120。各种关系类型的IBS分布情况如图2所示。

经Wilcoxon秩和检验，除了祖孙与叔侄（姨甥）的IBS评分差异无统计学意义（P=0.719）外，其余关系类

关系类型全同胞祖孙叔侄（姨甥）第一代堂表亲

判别函数

（姨甥）关系、第一代堂表亲关系、无关个体

FS、GG、UN、FC、UI分别代表全同胞关系、祖孙关系、叔侄

图25种关系类型基于90个SNP分型的IBS分布

2.4Fisher判别函数法进行亲缘关系判定

通过Fisher判别函数进行4种亲缘关系的判定，结果见表2。其中，全同胞关系全部被正确评判为相

应的亲缘关系，对于更远的亲缘关系，错判率显著升高。综合考虑无关个体的判定结果，判别函数法对全同胞关系判定的准确率最高（98.7%），对第一代堂表亲判定的准确率最低（61.3%）。

表2基于90个SNP分型建立的4种关系判别函数及分析结果

判定类型

特定亲缘关系/对无关个体/对

44014986273227773981317682449223936070.100.08概率密度全同胞

无关个体

错判率/%总错判率/%准确率/%

注：L表示判别评分，S表示IBS评分分值

LFS=3.9×S-289.7LUI=3.2×S-189.6LGG=3.4×S-221.1LUI=3.1×S-187.4LUN=3.5×S-233.4LUI=3.2×S-192.5LFC=3.3×S-204.5LUI=3.2×S-191.40.01.410.022.711.717.631.039.3无关个体

1.322.317.038.7

98.777.783.061.3

2.5IBS阈值法进行亲缘关系判定

基于前期研究，本研究模拟了10000对4种亲缘关系和无关个体样本，全同胞的IBS分布情况见图3。

参考《生物学全同胞关系鉴定实施规范》，本研究计算了在不同错判率下各类亲缘关系IBS评分的判定阈值及相应的系统效能，结果见表3。

从表3可以看出，在相同错判率下，全同胞关系鉴定的系统效能最高，第一代堂表亲关系鉴定效能最低。

[10]

t1

无法判定

t2

全同胞

0.060.040.020.00

90

100

110

120

130IBS

140

150

160

170

虚线位置代表错判率为0.05%时的判定阈值

图3基于90个SNP分型的全同胞IBS分布

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表3基于90个SNP分型建立的各种亲缘关系IBS判定阈值及系统效能关系类型

错判率%/

系统

下限值IBSt1上限值t2全同胞1.000.501330.985效能0.101321350.97240.051291371281401410.91290.8814祖孙、叔侄（姨甥）0.011.00126144

0.76440.50117135

0.29400.101160.20990.051131371131401410.09380.0824第一代堂表亲0.011.00111144

0.03890.50111135

0.06270.101101370.03720.051080.01520.011071401051411440.01030.00308另外，可根据此表灵活选择判定阈值。以全同胞

IBS关系评分为例≤128，当，设则判定为无关个体，定错判率≤0.05%时如果，如≥141果某，对则判定

样本为全同胞，相应的系统效能为0.8814，即88.14%的案

例可以获得明确的鉴定意见。

3讨论

目前，国内司法系统使用的《生物学全同胞关系鉴定实施规范》基于STR分型结果，采用IBS评分法提出判断全同胞、无法判断、无关个体的标准和检测效能[10]。相对于似然比（likelihoodratio）法，IBS评分法无需考虑等位基因频率，只需要根据等位基因共享情况即可进行亲缘关系判定，具有分析直观、简单、快速的优势

[11，13-15]

。另一方面，对于特殊案例，如高度腐

败或者降解检材，常常无法获得完整STR分型，而SNP

SNP由于扩增片段短可以获得完整分型。并且随着分型体系的日益成熟，将越来越广泛地应用于法NGS-[16]sion医学个体识别和亲缘鉴定IDIdentityPanel分型体系对，因此本研究采用90个SNP位点进

Preci⁃行分型，结合IBS策略探索了该检测体系在全同胞关

系鉴定中的应用价值。

本研究结果显示，全同胞、祖孙、叔侄（姨甥）和第

一代堂表亲4种亲缘关系中，除了祖孙与叔侄（姨甥）关系外，其余关系类型的IBS评分差异均有统计学意义，且均高于无关个体。祖孙与叔侄（姨甥）的IBS评分无显著差异，可解释为这两类亲缘关系同属于二级亲缘关系，理论上他们之间均共有四分之一的亲代遗传物质。另外，随着亲缘关系的疏远，IBS分值逐渐降

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低。亲缘关系中的第一代堂表亲与无关个体的IBS差异最小。

本研究根据90个SNP分型数据建立了4种亲缘关系的Fisher判别函数，综合无关个体的判定结果后对全同胞关系的错判率为1.3%，低于赵书民等[12]研究中的2.98%。分析原因为本研究包含的90个SNP位点相当于22个STR基因座的多态性[17]，多于赵书民等研究中采用的Identifiler系统STR数目（15个STR）。但是，对于其他较远亲缘关系的错判率较高，尚不能满足实践需求。

此外，由于判别函数法具有“是”或者“否”的二分类特征，不存在无法判定的“灰色区域”，系统效能高，但是错判率相对也较高。本研究采用判别函数法进行全同胞关系的错判率为1.3%，显著高于根据《生物学全同胞关系鉴定实施规范》及赵书民等[12-13]研究采用19个STR和IBS阈值法（t1≤0.05%）。本研究基于前期获得的频率数据，=13，t2=22）的错判模拟

率

IBS了10000对各种亲缘关系和无关个体，获得了相应的

行全同胞鉴定的系统效能为判定阈值。结果表明，当错判率低至STR时的效能（0.75）0.8814，高于采用0.05%时，19进

个

[10]，提示这90个SNP可以应用于

全同胞关系鉴定。因此，当采用这90个SNP进行鉴

定时，推荐使用对应的阈值t1的判定标准。如果允许的错判率提高，=128、t2=141相应的系统效作为全同胞

能更大。实际工作中可以根据需要，选择不同的标准和阈值进行判定，这也显示了IBS阈值法的灵活性。

值得一提的是，检测体系包含的SNP位点数目越多，对于各类亲缘关系鉴定的鉴别能力以及准确率越高。KLING等[18-19]应用高密度SNP芯片技术检测了超过90万个SNP位点，以共有等位基因数目作为判定参数，发现可以区分至第二代堂兄弟（姐妹）的关系。这也显示了SNP遗传标记和IBS策略在亲缘关系鉴定中的应用潜力，本研究下一步拟基于更大数量的实验样本和实际案例进行验证。

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（收稿日期：2018-12-18）

（本文编辑：张素华）