烟草根际固氮菌的筛选、鉴定及优化培养

中国烟草学报Ａｃｔａ　Ｔａｂａｃａｒｉａ　Ｓｉｎｉｃａ　ｈｔｔｐ：／／ｙｃｘｂ．ｔｏｂａｃｃｏ．ｏｒｇ．ｃｎ　ｄｏｉ：１０．１６４７２￣．ｃｈｉｎａｔｏｂａｃｃｏ．２０１４．４０８　８９　烟草根际固氮菌的筛选、鉴定及优化培养　刘晓璐　，杨柳青　，吕乐　，郭涛２，刘永智　，赵鹏　，董昕　，闫海　１北京科技大学化学与生物工程学院，北京１０００８３；　２山东省农业科学院水稻研究所，济南２５０１００　摘要：对四川广元烟草主产区三个种植基地的烟草根际固氮菌进行筛选，分离出２８株具有固氮活性的菌株。经扩增ｒＤＮＡ限　制性酶切片段分析法（ＡＲＤＲＡ）初步分类，共获得５个操作分类单元（ＯＴＵ），并由１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列进行了分析鉴定。结果表明不　同分类单元分别是：苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和炭疽杆菌。优化了Ｎ７菌株（巨大　芽孢杆菌）培养条件，确定其最佳碳源为蔗糖，最适宜初始ｐＨ值为７．５，最适温度为３０￣Ｃ。　关键词：烟草；固氮菌；筛选；１６ｓ　ｒＤＮＡ；优化培养　引用本文：刘晓璐，杨柳青，吕乐，等．烟草根际固氮菌的筛选、鉴定及优化培养［Ｊ］．中国烟草学报，２０１５，２１（１）　氮是烤烟生长过程中最重要的营养元素之一，其　供应量的高低对烤烟生长以及产量质量具有重要的影　响［１］。在烤烟吸收的氮营养中，６０％以上来自于土壤，　肥料氮仅占总氮量的３５％左右［２。】，因此，提高土壤　供理论依据。　１材料与方法　１．１土壤和菌种　土壤样品取自四川省广元市的烟草种植区，取样　地点为植烟时间１Ｏ年以上，且烟草质量、产量都较　高的种植区。将取得的土壤样本在生理盐水中稀释后　涂布到Ａｓｈｂｙ无氮培养基平板上，２５￣Ｃ恒温培养７　ｄ。　供氮量对烤烟获得高产具有重要的实践意义。为提高　土壤供氮能力，部分学者提出了采用生物固氮菌来提　高烤烟的固氮和供氮能力，并且取得了一定的研究成　果。卢江平　和阎启富【５　于１９９６年进行了生物固氮　菌在烤烟上的应用效果试验，结果表明，生物固氮菌　的应用可以显著提高烤烟产量和产值，特别是不施用　取长势良好的单克隆菌落，在Ａｓｈｂｙ培养基上划线培　养２　ｄ，用接种针取菌划线转接到牛肉膏蛋白胨培养　基上培养，获得固氮菌纯化菌株，保存于一２Ｏ℃。　氮肥处理，烤烟栽培经济效益提高显著高于施用氮肥　处理，证明生物固氮菌对促进烤烟生长具有良好的作　用；王豹祥研究了不同菌种对烤烟养分吸收以产量质　量的影响规律，结果表明，固氮菌处理烤烟产量提高　９．１２％，产值提高３０％以上，而化肥使用量降低了　２６％；罗红燕【　研究证明，ｖＡ菌根可以显著促进烤　１．２培养基　Ａｓｈｂｙ培养基：ＫＨ２ＰＯ４　０．２　ｇ，ＣａＣＯ３　５　ｇ，　ＭｇＳ０ｉ７Ｈ２０　０．２０　ｇ，甘露醇１０　ｇ，ＮａＣ１　０．２　ｇ，琼脂１８　ｇ，　ＣａＳ０４＂２Ｈ，Ｏ　０．１　ｇ，蒸馏水１　０００　ｍＬ。　牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏５　ｇ，蛋白胨１　ｇ，　ＮａＣ１　５　ｇ，琼脂１８　ｇ，蒸馏水１　０００　ｍＬ。　１．３　１６Ｓ　ｒＤＮＡ鉴定　烟生长，氮磷钾养分利用率可以提高１０％以上，植　株干物质积累量提高２０％以上，土壤内微生物数量　提高幅度达到１６３．２％，土壤内有效氮磷钾提高１２％　以上，对提高烤烟经济效益具有重要的作用。烤烟固　生工ＳＫ８２５５提取全基因组试剂盒提取筛选的固　氮菌全基因组ＤＮＡ。ＮＡＮＯＤＲ０Ｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ）检　氮菌的施用导致烤烟产量升高的主要原因是固氮微生　物可以较好的为烤烟提供氮素营养，促进烤烟对氮元　素的吸收和利用［８　；在目前固氮菌的研究中，鲜有根　测ＤＮＡ的质量和浓度并将ＤＮＡ工作浓度调至１００．　２００　ｎｇ／１．ｔ　Ｌ。采用Ｂｉｏｍｅ￣ａ扩增仪（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）　ＰＣＲ扩增。扩增体系：９８℃预变性３０ｓ；９８℃变性　际固氮菌及其固氮能力的报道【９】。本文研究了烤烟根　系固氮菌的应用与筛选，以期为该菌种的生产应用提　基金项目：北京高等学校青年英才计划项目（Ｎｏ．ＹＥＴＰ０３９４）　１０ｓ，５８℃复性３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；再　延伸ｌＯｍｉｎ。ＰＣＲ反应总体系为２０　Ｌ，其中ｄｄＨ　Ｏ　６．４　作者简介：刘晓璐（１９８３一），博士，副教授，主要研究方向为功能基因组学、资源与应用微生物学，Ｅｍａｉｌ：ｘｉａｏｌｕｌｉｕ＠ｕｓｔｂ．ｅｄｕ．ｃｎ　通讯作者：闫海（１９６２一），博士，教授，主要研究方向为环境微生物学，Ｅｍａｉｌ：ｈａｉｙａｎ＠ｕｓｔｂ．ｅｄｕ．ｃａ　收稿日期：２０１４．１０．１２　山ｕ。詈０　Ｉ，　７　６　５　４　３　２　１　０　中国烟草学报Ａｃｔａ　Ｔａｂａｃａｒｉａ　Ｓｉｎｉｃａ　２０１５　Ｖｏ１．２１　Ｎｏ．１　优化培养结果　３结论与讨论　８　亘｝ｇ　０∞　Ｑ０　６　４　２　Ｏ　．●一蔗糖　．｜卜葡萄糖　．●●一甘油　＋甲醇　＋　醇　图５不同碳源对Ｎ７生长的效应　Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｎ７　图５显示，Ｎ７可利用的碳源较广泛，除甲醇和　乙醇效果稍差外，葡萄糖、蔗糖、甘油均为较好的碳　源被Ｎ７利用，且以蔗糖为碳源的培养基生长量最高。　２５　３Ｏ　３５　４０　温度／￣Ｃ　５　５０　６　００　６　５Ｏ　７．００　７．５０　８．００　初始ｐＨ值　图６不同温度和初始ｐＨ值和对Ｎ７生长的效应　Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅｓ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆＮ７　初始ｐＨ值和培养温度的单因素实验结果表明（图　６），Ｎ７在初始ｐＨ值６．５—７．５均能生长，快速生长的　最优初始ｐＨ值为７．５０。Ｎ７菌株的培养温度在２５．　４０￣Ｃ范围内均可生长，３０￣Ｃ是培养Ｎ７的最佳温度。　白生固氮菌是一类生活在土壤有机质中促进植物　目ｃ０∞　（１０　Ｏ　８　６　４　２　０　生长的根际细菌［１２］ｏ本试验筛选出的固氮菌都属于　自生固氮菌，均为杆菌。苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢　杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌都是具有　固氮功能的细菌。　Ｎ７的１６Ｓ序列与Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ相似性达　到９８％，可推断这个菌株是巨大芽孢杆菌。巨大芽　孢杆菌是一种益生菌，在２０世纪４０年代，巨大芽　孢杆菌就已进行实验研究，学者Ｓｕｎｄａｒ、Ｍｏｌｌａ以及　Ｅｌｌｏｔｔ等发现以巨大芽孢杆菌为核心制成混合菌剂，　可降解难以溶解的含磷化合物［１３－１５］。１９５８年Ｈｉｎ在　日本首次分离得一株具有高固氮活性的巨大芽孢杆　菌，相对于生物肥料来说，巨大芽孢杆菌具有自身独　特的优良特点，其生存能力及适应能力较强，对于在　非人工氮素供应上这类菌株将起着十分重要的作　用［１６－１　。巨大芽孢杆菌不仅具有高效降解烟草中亚硝　酸盐的功能＿ｌ　，更有研究表明由巨大芽孢杆菌制成　的微生物制剂喷洒在烟草叶片上，能有效的提高叶片　的香味，并且降低蛋白质含量，对烟草的品质有很大　提高ｆ１　。并且巨大芽孢杆菌与节杆菌双菌种共同作　用能有效提高废次烟叶的综合利用和烟草薄片质量，　这对烟草企业有巨大的经济意义『２…。　Ｎ２、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ９、Ｎ１０的１６Ｓ序列与Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ相似性达到９８％，由此可推断这几个菌株是　枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌是一种益生菌，不仅能　够提高植物种子的发芽率，更具有固氮活性［２１］０目　前有研究表明，枯草芽孢杆菌是一种内生固氮菌，定　殖在宿主植物体内，直接分泌固氮产物给植物吸收，　不易受到外界环境条件的干扰，更有利于充分发挥固　氮效能，表现出更高的固氮效率［２２］ｏ在甘蔗内生固　氮菌的研究中，证实了枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌　的高效固氮活性［２３］ｏ　Ｅｎｇｌｉｓｈ等研究显示，烟叶分别　或混合接种枯草芽孢杆菌和环状芽孢杆菌后，能迅速　产生一种令人愉悦的香气［２４］ｏ并且研究表明利用枯　草芽孢杆菌还可以高效防治烟草青枯病［２　。　Ｎ１的１６Ｓ序列与Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ相似性　达到９９％，由此可推断该菌为苏云金芽孢杆菌。苏　云金芽孢杆菌不仅常用作微生物杀虫剂，也具有高　效固氮功能。Ｎ４、Ｎ８、ＮＩ２的１６Ｓ序列与Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ相似性达到９９％，由此可推断这几　个菌是甲基营养型芽孢杆菌，具有高效固氮功能。但　是目前对苏云金芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌的固　刘晓璐等烟草根际固氮菌的筛选、鉴定及优化培养　氮功能研究相对较少，这两个菌种的固氮活性需要做　进一步的研究。ＡＲＤＲＡ的分析结果大致一致，证实　了我们分类的正确性。　本试验对巨大芽孢杆菌的适宜培养条件、最适　ｐＨ值等进行了研究。把蔗糖作为Ｎ７的最优碳源进　行下一步的研究。与蔗糖相比，葡萄糖属于单糖，一　般较容易被细菌利用，但在其代谢过程中产酸速度较　快，从而使得培养基ｐＨ值快速降低，这可能是导致　其生长量较蔗糖低的主要原因［９】。Ｎ７快速生长的最　优初始ｐＨ值为７．５０，菌株在中性或偏碱性的条件下　生长好，这与文献报道的植物生长促生菌的适宜培养　条件一致［２６－２９］ｏ在温度优化培养中，Ｎ７的最适生长　温度是３０℃，可能是由于较低的温度（２５℃），菌　体新陈代谢较慢，导致菌生长和分裂速度受影响；较　高的温度（４０℃），由于该温度超过了菌体内酶的最　适温度，使得其催化效率有所下降，从而影响了细菌　的生长。　参考文献　【１】　王鹏，张吉立，李洋，等．大豆饼肥对烤烟氮积累及烟　叶产值的影响［Ｊ１．干旱地区农业研究，２０１２，５：１４３．１４６．　［２］　苏帆，付利波，陈华，等．应用１５Ｎ研究烤烟对饼肥氮　素的吸收利用规律［Ｊ］．中国生态农业学报，２００８，２：３３５．　３３９．　［３】　习向银，赵正雄，李春俭．肥料氮和土壤氮对烤烟氮素　吸收和烟碱合成的影响［Ｊ］．土壤学报，２００８，４：７５０．７５３．　［４】　卢江平，李安源．生物固氮菌在烤烟上的应用［Ｊ］．烟草　科技，１９９６（５）：３２．３６．　［５］　阎启富．共生性固氮菌在山地烤烟上的应用［Ｊ］．烟草科　技，１９９７（４）：１２．１５．　［６　６］王豹祥，李富欣，张朝辉，等．应用ＰＧＰＲ菌肥减少烤　烟生产化肥的施用量［Ｊ］．土壤学报，２０ｔ１，４：８１３．８２２．　［７】　罗红燕．ＶＡ菌根真菌对烤烟生长及根际土壤微生态环　境的影响［Ｄ］．重庆：西南农业大学，２００２：１７－２６．　［８】　唐凤灶．安徽铜陵铜尾矿原生演替过程中的土壤固氮菌　研究［Ｄ］．广卅ｆ：中山大学，２０１０：１．５８．　［９】　姚拓，张德罡，胡自治．高寒地区燕麦根际联合固氮菌　研究［Ｊ］．草木学报，２００４，２（１３）：１０６．１１０．　［１０］　谢光辉，苏宝林，崔宗均．长江流域水稻根际芽孢杆菌　属固氮菌株的分离和鉴定［Ｊ］．微生物学报，１９９８，３８（６）：　４８０．４８３．　［１１】　尤崇杓．水稻根际联合固氮菌［Ｍ］＿北京：农业出版社，　１　９９０：３２９．３３５　９３　Ｇｌｉｃｋ　Ｂ　Ｒ．Ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｙ　ｆｒｅｅ。ｌｉｖｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃａｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５，４１：１０９－１１７．　Ｓｕｎｄａｒ　Ｏ，Ｒａｃａｎｄ　Ｗ　Ｂ，Ｓｉｎｈａ　ＭＫ．Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｉｎｄｉａ　Ａｇｆｉｃ　Ｓｃｉ，１９６３，３３（４）：２７２－２７８．　Ｍｏｌｌａ　ＭＺ．Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ　ＭＡ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｎ　ｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｓｏｉｌ，１９８４，７８（１）：　３９３．３９９．　Ｅｌｌｏｔｔ　ＪＭ，Ｍａｔｈｒｅ　ＤＥ，Ｓａｎｄｓ　ＤＣ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８７，５３（２）：２７９３—２７９９．　覃小红．固氮巨大芽孢杆菌在桉树栽培上的应用初探　［Ｄ】．广西：广西大学，２０１３：１－６．　Ｊａｖｉｅｒ　Ｍａｒｉａ　Ｉ．Ｇａｒｃｉａ—Ｓｆｉｎｃｈｅｚ，ｅｔ　ａ１．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ．ｎｉｔｒｉｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｍｉｃｒｏａｌｇａ　Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ　ｂｒａｕｎｉｉ［Ｊ】．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，４０：４０１－４０５．　　．杨艳．巨大芽孢杆菌产亚硝酸盐还原酶的研究［Ｄ］．沈阳：　沈阳农业大学。２００７：１－４０．　汪长国，戴亚，朱立军，等．采收前叶面喷施微生物制剂　改善烟叶品质试验［Ｊ］．烟草科技，２００６，４：３１．３４．　艾继涛．双菌种发酵提高烟草薄片和废次烟叶品质研究　［Ｄ］．北京：中国农业大学，２００６：１－５３．　振粉．牧草内生枯草芽孢杆菌的功能多样性及其１６Ｓ　ｒＤＮＡ鉴定［Ｄ】．甘肃：甘肃农业大学，２０１０：１－５９．　丁国春，付鹏，李红梅．枯草芽孢杆菌ＡＲ１１菌株对南　方根结线虫的生物防治［Ｊ］．南京农业大学学报，２００５，　２８（２）：４６－４９．　周发俊．甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及１６ＳｒＩ　Ａ基因　克隆和序列分析【Ｄ］．福建：福建师范大学，２００９：１－５２．　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ＣＦ，Ｂｅｌｌ　ＥＪ，Ｂｅｒｇｅｒ　ＡＪ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ　ｆｒｏｍ　ｂｒｏａｄｌｅａｆ　ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｉｇａｒ　ａｒｏｍａ　ａｎｄ　ｍｉｌｄｎｅｓｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ，　１９６７，１５：１１７—１１９．　易有金，罗坤，罗宽，等．内生枯草芽孢杆菌Ｂ．００１菌株　内生定殖研究及生物学特性［Ｊ］．核农学报，２００７，２１（４）：　３４９—３５２．　张高峡，卢振祖．作物根际联合固氮芽孢杆菌的分离鉴　定及生态分布［Ｊ］．氨基酸和生物资源，１９９８，２０（１）：１２．　１５．　刘荣昌，李凤汀．小麦接种联合固氮菌增产效果研究［Ｊ］．　华北农学报，１９８９，４（３）：７４．８４．　李永兴，王继文，李久蒂．玉米根际联合固氮菌的基本　特性的研究［Ｊ］．微生物学报，１９９３，３３（６）：１５１—１５８．　方敦煌，赵玉虎，沐应祥．拮抗菌株ＧＰ１３的基本生物学　特性的研究［Ｊ］．西南农业大学学报，２００２，２４（４）：３５９．３６１．　中国烟草学报Ａｃｔａ　Ｔａｂａｃａｒｉａ　Ｓｉｎｉｃａ　２０１５　Ｖｏ１．２１　Ｎｏ．１　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＩＵ　Ｘｉａｏｌｕ　，ＹＡＮＧ　Ｌｉｕｑｉｎｇ　，ＬＹＵ　Ｌｅ　，ＧＵＯ　Ｔａｏ　，ＬＩＵ　Ｙｏｎｇｚｈｉ　，ＺＨＡＯ　Ｐｅｎｇ　，ＤＯＮＧ　Ｘｉｎ　，ＹＡＮ　Ｈａｉ　１　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅＯｉｎｇ　１　０００８３，Ｃｈｉｎａ　２　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｒｉｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉｎａｎ　２５０　１　００，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｗｅｎＷ　ｅｉｇｈｔ　ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓｏｉｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｇｕａｎｇｙｕａｎ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ａｒｅａ，Ｓｉｃｈｕａｎ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ．　Ｔｈｅｓｅ　ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｆｒｅｅ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｍｅｄｉｕｍ．Ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｒＤＮＡ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＲＤＲＡ）ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｌａｓｓｉｉｆｅｄ　ｉｎｔｏ　５　Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｕｎｉｔｓ（ＯＵＴ）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＯＵＴｓ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｂｙ　１　６Ｓ　ｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ　ｔｈｏｓｅ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ　ａｓ　Ｂａｃｉｌｆｌｕｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ａｎｄ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ．Ｔｈｅ　ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅ　Ｎ７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｖｉａ　ａｄｊｕｓｔｉｎｇ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐＨ　ｖａｌｕｅｓ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｓｕｃｒｏｓｅ　ｉＳ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｉＳ　７．５，ａｎｄ　ｈｅ　ｔｂｅｓｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉＳ　３０℃．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｏｂａｃｃｏ；ｎｉｔｒｏｇｅｎ—ｆｉｘｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；１　６Ｓ　ｒＤＮＡ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　Ｃｉｔａｔｉｏｎ：Ｌｉｕ　Ｘｉａｏｌｕ，Ｙａｎｇ　Ｌｉｕｑｉｎｇ，Ｌｙｕ　Ｌｅ，ｅｔ　ａ１．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｕｒｔｅ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｉｆｘｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｔａｂａｃａｒｉａ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１５，２１（１）　烟草科技　２０１５年第２期目次　・烟草农学　基于芯片数据的烟草ｑＲＴ－ＰＣＲ内参基因鉴定与验证　………………“干头干尾”烟丝挥发性香味物质的主成分聚类分析　………………………刘泽，何邦华，杨蕾，唐军，　王燃，许亚龙，李泽锋，卢鹏，孟利军，曹培健　…不同种类绿肥翻压对植烟土壤理化性状的影响　邓小华，石楠，周米良，田　峰，陈前锋，　……………周冰，侯英，朱勇，邱昌桂　ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ法测定新鲜烟草中的脱落酸和茉莉酸　…………………………陈霞，陈干思，刘萍萍，翟妞，　赵炯平，江智敏，菅攀锋，覃…………………………勇　…………金立锋，郑庆霞，周会娜，林福呈　灰分校正对范氏洗涤法同时测定烟草中ＡＤＦ和ＡＤＬ的影响　张婕，葛永辉，向章敏，周淑平，杨慧，耿召良　２，３．吡嗪二甲酸二茴香酯的合成及其热裂解　………………深翻和施用土壤改良剂对烟草青枯病发生的影响　万川，蒋珍茂，赵秀兰，魏世强，　李玲，马冠华，徐畅，陈益银　储藏醇化措施对烤烟烟包内温湿度及烟叶品质的影响　程昌新，王超，杨应明，王玉，董石飞，　………………付培培，赵铭钦，来苗，包晓容，姬小明，　王鹏泽，尤方芳，陈发元　・何晓健，刘媛嫒，李……………………………………伟，叶协锋　烟草工艺　……………贵州喀斯特山区烟叶高光谱参数与叶绿素含量的关系　付虎艳，靳涵丞，张洪亮，　张军，潘高潮，舒清态　基于低能Ｘ射线透射成像的打叶片烟中烟梗在线检测　…朱文魁，刘斌，毛伟俊，席建平，钟科军，　・烟草化学　主流烟气中氨与部分羰基化合物的偏相关分析及应用　………………张辉，王艺斌，黄岗，陈良元　基于ｔ假设检验及ＳＶＭ神经网络的卷烟真伪判定…魏中华　微波膨胀条状梗丝应用效果评价　丁美宙，熊安言，王海滨，李全胜，孙觅，王二彬　沈晓晨，曹美，张华，庄亚东，曹莹，王珂清　毅，　…………刘献军，朱怀远，朱………・设备与仪器　Ｉｍａｇｅ。Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ技术在沟槽滤棒特征参数测量中的应用　赵亮，徐玉中，应伟，章军，刘万里，邱建雄，张博　………离子色谱法测定卷烟侧流烟气中的甲胺和乙胺　刘伟，张艳芳，李杰辉，陈伟华，胡立朝，苏国岁　烤烟香型与产区及品种的关系研究　张霞，张涛，段沅杏，王………………基于计算机视觉的片烟形状测量方法　岚，杨光宇，　…………………徐大勇，王澍，张龙，李新锋，范明登　陈永宽，缪明明，刘志华　ｊ乙酸甘油酯酸度的电动连续分液器快速滴定　边照阳，刘珊珊，杨飞，李中皓，张洪非，唐纲岭　………张文，夏营威，高震宇，堵劲松　异形烟包六面整形装置的设计………………钟龙圣，廖艳培