一、培养基（阅读教材P14～15）
1．概念
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。 2．种类
按照培养基的物理状态划分为液体培养基和固体培养基。 3．营养要素
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
二、无菌技术（阅读教材P15～16）
1．获得纯净培养物：关键是防止外来杂菌的入侵。 2．无菌操作主要包括以下四个方面
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。
(3)为避免周围环境中微生物的污染， 实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 (4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 3．消毒和灭菌 (1)消毒
①概念：使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
②常用的方法有煮沸消毒法和化学药剂消毒法。 (2)灭菌
①概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。 ②常见的方法有：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
三、大肠杆菌的纯化培养（阅读教材P16～20） 1．制备固体培养基
2．纯化大肠杆菌
(1)微生物接种最常用的方法 ①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(2)微生物培养分析
①如果接种了大肠杆菌的培养基上生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，说明接种操作符合要求。
②若培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中被杂菌污染。 ③未接种大肠杆菌的空白对照的培养基在培养过程中若长出菌落，说明灭菌不彻底，实验失败。
四、菌种保存（阅读教材P20） 适用对象 培养基类型 温度 方法 缺点 临时保藏法 频繁使用的菌种 固体斜面培养基 4_℃ 菌落长成后于冰箱中保存，每3～6个月将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上 菌种易被污染或产生变异 甘油管藏法 长期保存的菌种 液体培养基 －20_℃ 将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后于冷冻箱内保存 /
[共研探究]
1．下面是察氏培养基(培养霉菌所用)的主要成分，根据下表，回答下列问题： 蔗糖 20 g NaNO3 3 g K2HPO4 1 g KCl 1 g MgSO4· 7H2O 0.5 g FeSO4 0.01 g 琼脂 20 g 水 定容至 1 000 mL (1)该培养基根据物理性质划分应是固体培养基，原因是该培养基中加入了凝固剂琼脂。 (2)该培养基包含微生物生长和繁殖所需要的 4类营养物质(成分)，分别是碳源、氮源、无机盐和水。有时候还需要加入特殊的营养物质(生长因子)。
(3)①蔗糖提供碳源，除此之外，提供碳源的主要有：a.无机化合物CO2、Na2CO3等；b.有机化合物糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等。
②NaNO3提供氮源和无机盐。
(4)碳源、氮源、生长因子在微生物体内的作用 营养要素 碳源 氮源 生长因子 作用 构成生物体细胞的物质和一些代谢产物， 有些是异养微生物的能源物质 合成蛋白质、核酸及含氮代谢废物 酶和核酸的组成成分 【总结提升】 某些微生物的代谢及特点
(1)硝化细菌：自养，需NH3或亚硝酸盐做氮源。 (2)圆褐固氮菌：异养，培养基中不需加氮源。
(3)金黄色葡萄球菌：异养，培养基中需加高浓度食盐。 (4)破伤风杆菌：异养厌氧。 2．无菌技术
(1)目的：防止外来杂菌的入侵。 (2)消毒和灭菌的比较
项目 概念 常用 方法 适用 对象 (3)连线
消毒 使用较为温和的物理或化学方法杀死 物体表面或内部的部分微生物(不包 括芽孢和孢子) 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂 消毒法 操作空间、操作者、一些液体等 灭菌 用强烈的理化因素杀死物体内外所有 的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌 接种环、接种针、玻璃器皿、培养 基等
(4)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。
【易错易混】
(1)消毒与灭菌的最根本区别：芽孢和孢子是否存活。灭菌能杀死芽孢和孢子，因而灭菌更彻底。
(2)具体选择消毒还是灭菌需要考虑：一是效果，灭菌的效果比消毒要好；二是操作对象的承受能力，活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。
[总结升华]
1．培养基的成分 营养物质 碳源 作用 能为微生物代谢 提供碳元素 能为微生物的代谢 提供氮元素 是生长必不可少的 是生命活动所必需的 为微生物提供除碳、 氮以外的各种重要 功能 构成生物体的细胞物质 和一些代谢产物，有些 是异养生物的能源物质 合成蛋白质、核酸以及 含氮的代谢产物 酶和核酸的组成成分 不仅是优良的溶剂而且 可维持生物大分子结构 的稳定 细胞的组成成分，生理 调节物质，某些化能 主要来源 无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等 无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 维生素、氨基酸、碱基等 外界摄入 氮源 生长因子 水 无机盐 无机化合物 元素，包括大量元素 【易错易混】
自养菌的能源，酶的激 活剂 (1)对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源又是氮源、能源。 (2)一些天然营养物质，如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子。
(3)不同微生物对营养的需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。
(4)营养物质过少不能满足微生物的营养需要，过多对微生物的生长有抑制作用。 (5)自养型微生物的碳源是无机碳(如CO2)，异养型微生物的碳源是有机碳(如糖类)，由此可见培养不同类型的微生物，所用的培养基的组成成分不同，但一般微生物所需的营养物质可分为五类：碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。
2．常用灭菌和消毒方法的比较 巴氏消 毒法 灼烧 灭菌 主要方法 70～75 ℃煮30 min或 80 ℃煮15 min 应用范围 牛奶、啤酒、果酒和酱油等 不宜进行高温灭菌的液体 微生物接种工具：如接种环、 接种针或其他金属用具等， 接种过程中的试管口或瓶 口等 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、 金属用具等不适宜用其他方法 灭菌而又耐高温的物品 培养基及多种器材、物品 家庭餐具等生活用品 的消毒 接种室空气 用于皮肤、伤口、动植物组织 表面消毒和空气、手术器械、 塑料或玻璃器皿等的消毒 酒精灯火焰灼烧 干热 灭菌 高压蒸 汽灭菌 煮沸消 毒法 紫外线 消毒 化学药 物消毒
干热灭菌箱160～170 ℃ 加热1～2 h 100 kPa、121 ℃维持 15～30 min 100 ℃煮沸5～6 min 30 W紫外灯照射30 min 用体积分数为70%～75% 的乙醇、碘酒涂抹，来苏 尔喷洒等 [对点演练]
1．防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是( )
A．实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒
B．接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
C．在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染
D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
解析：选B 对接种环等金属用具进行灼烧灭菌，应放在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰处灼烧灭菌。
[共研探究]
1．完成下面的实验过程 (1)培养基的配制
(2)灭菌
(3)倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近进行下列操作： ①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞(如图1)。
②使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是进行灭菌，防止瓶口微生物污染培养基(如图2)。
③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖(如图3)。
④等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置(如图4)，原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2．纯化大肠杆菌
纯化大肠杆菌是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，接种时尽量接种单个的大肠杆菌，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
(1)平板划线法
结合示意图，完成下面步骤：
操作示意图 操作 将接种环放在酒精灯火焰上灼烧， 直到接种环烧红 在火焰旁冷却接种环，并打开盛有 菌液的试管的棉塞 将试管口通过酒精灯的火焰 将已冷却的接种环伸入菌液中， 沾取一环菌液 将试管口通过酒精灯的火焰， 并迅速塞上棉塞 左手将培养皿皿盖打开一条缝隙，右手将 沾有菌种的接种环迅速伸入平板内， 划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不 要划破培养基 灼烧接种环，冷却后，从第一区域划线的 末端开始往第二区域内划线。重复以上操作， 在三、四、五区域内划线。注意不要将 最后一区的划线与第一区相连 将平板倒置，放入培养箱中培养 (2)稀释涂布平板法
结合示意图，完成下面步骤： ①系列稀释操作
a．将盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
b．用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀。
c．从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管内吹吸均匀，获得102倍稀释液。依次类推，直到完成最后一只试管的稀释。
②涂布平板操作
结合图示，完成下列操作： 操作 示意图 操 作 将涂布器浸在盛 有酒精的烧杯中 取不超过0.1_mL的 菌液，滴加到 培养基表面 将沾有少量酒精 的涂布器在火焰 上引燃，待酒精 燃尽后，冷却8～ 10_s 用涂布器将菌液 均匀地涂布在培 养基表面。涂布 时可转动培养 皿，使菌液分布 均匀 ③菌种的保存 a．为了保持菌种的纯净，需将菌种放在低温环境中保藏，目的是降低微生物的新陈代谢速率。
b．保存菌种的方法 菌种类型 保存方法 具体方法 将菌种接种到试管的固 体斜面培养基上，在合适 的条件下培养，长成菌落 后，放入4_℃的冰箱中 保藏 在3 mL的甘油瓶中，装 入1 mL甘油后灭菌。将 1 mL菌液转移到甘油瓶 中，与甘油充分混合 [总结升华]
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等)，如生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定所用培养基内必须加入已知化学成分的物质。
(2)营养要协调，注意各种营养物质的浓度和比例
①营养物质浓度过低不能满足微生物的营养需求，过高对微生物的生长有抑制作用。 ②培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为4∶1时，菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；当碳源与氮源的比为3∶1时，菌体繁殖受到抑制，但谷氨酸合成量大增。
(3)pH要适宜，各种微生物适宜生长的pH范围不同，细菌6.5～7.5、放线菌7.5～8.5、真菌5.0～6.0。
2．平板划线法中不同时期灼烧接种环的目的
烧灼时期 取菌种前 目的 杀死接种环上原有微生物 杀死上次划线后接种环上的残留菌种， 使下次划线的菌种直接来自于上次划线 末端，使每次划线菌种数目减少，达到 分离菌株的目的 杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环 境和感染操作者 后续处理 每3～6个月需重新接 种，否则菌种容易被污 染或产生变异 频繁使用 的菌种 临时 保藏法 长期保存 的菌种 甘油 管藏法 放入－20_℃的冷冻箱 中保存 每次划线前 接种结束后 3.稀释涂布平板法的注意事项
(1)酒精灯与培养皿的距离要合适。 (2)吸管头不要接触任何其他物体。 (3)吸管要在酒精灯火焰周围使用。
[对点演练]
2．如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为l→2→3→4→5。下列操作方法正确的是( )
A．操作前要将接种环放在火焰旁灭菌 B．划线操作要在火焰上进行
C．在5区域中才可以得到所需菌种的菌落
D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌
解析：选D 操作前要将接种环放在酒精灯的外焰灼烧进行灭菌；整个操作过程要在酒精灯旁进行；1、2、3、4、5这5个区域都可能有所需菌种的菌落；在每次划线前对接种环灼烧是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，划线结束后对接种环灭菌是为了杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
1．不同培养基的具体配方不同，但一般都含( ) A．碳源、磷酸盐和维生素 B．氮源和维生素
C．水、碳源、氮源和无机盐
D．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素 答案：C
2．下面对微生物培养中灭菌的理解不正确的是( ) A．防止杂菌污染
B．灭菌就是杀死培养基中的杂菌
C．培养基和培养设备都必须进行灭菌 D．灭菌必须在接种前
解析：选B 灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭
全部微生物。
3．如图甲、乙是稀释涂布平板法中的部分操作，丙是平板划线法操作结果。下列叙述错误的是( )
A．乙图中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液
B．对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C．丙图培养皿中所得的菌落都符合要求
D．丙图中连续划线的起点都是上一次划线的末端
解析：选C 灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确。稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确。平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误。连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。
4．下面为牛肉膏蛋白胨培养基的成分列表，据此回答： 成分 含量 牛肉膏 0.5 g 蛋白胨 1 g NaCl 0.5 g H2O 100 mL (1)蛋白胨在培养基中的作用是___________________________。 (2)要用此材料配制观察细菌菌落状况的培养基，还需添加的成分是____________。 (3)确定表中各成分含量依据的原则是_______________________________。
(4)培养基配制好后，分装前应进行的工作是______________________________。 (5)从配制培养基直到培养完成，所采用的预防杂菌污染的方法有________________。 (6)在培养基凝固前要搁置斜面，其目的是____________________________。
解析：蛋白胨中含有大量的蛋白质降解而成的多肽类物质等，因而在培养基中提供碳源、氮源和生长因子。细菌菌落是在固体培养基上形成的。确定各营养成分含量要依据所培养的微生物的需要。培养基配制好后，首先要调整pH，然后再分装，整个操作过程都要保证无
杂菌污染。
答案：(1)提供碳源、氮源、生长因子 (2)琼脂(凝固剂) (3)所培养微生物对各营养成分的需要量 (4)调整pH (5)对培养基进行高压蒸汽灭菌、灼烧接种环、酒精棉擦手、在火焰旁接种、在火焰旁迅速用棉塞塞住试管口 (6)扩大接种面积
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