实验内容：
一、 蛙的坐骨神经-腓肠肌标本的制备 二、 骨骼肌收缩的实验
课程名称：动物生理学实验 指导老师： 实验人 ： 院系专业： 学 号 ：
2010年10月20日
实验内容一 蛙的坐骨神经-腓肠肌标本的制备（4-1）
【实验目的】
1、 学习蛙类动物单毁髓与双毁髓的方法。
2、 学习并掌握蛙类坐骨神经-腓肠肌标本的制备方法。 【实验原理】
蛙类的一些基本生命活动和生理功能与恒温动物相似，而其离体组织所需的生活条件比较简单，易于控制和掌握。因此在实验中常用蟾蜍或青蛙的坐骨神经-腓肠肌标本来观察兴奋与兴奋性、刺激与肌肉收缩等基本生理现象和过程。制备坐骨神经-腓肠肌标本室生理学实验中必须掌握的一项基本技能。 【实验器材】
常用手术器械（包括粗剪刀、手术剪、手术镊、眼科剪、眼科镊、金属探针、玻璃分针）、固定针、锌铜弓、蜡盘、培养皿、废物缸、棉线、纱布、滴管、任氏液。 【实验对象】
蛙 【实验步骤】
1、 毁脑和脊髓
取青蛙一只，用纱布包裹青蛙的四肢和躯干，露出头部。左手握住青蛙，并用食指按压头部前端，拇指按压背部使头部前俯；右手找到青蛙枕骨大孔所在位置。将探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即进入枕骨大孔，这时将探针由枕骨大孔转向头方，向前探入颅腔内，然后向各个方向搅动探针，以捣毁脑组织。如探针确实在颅腔内，可感觉出针在四面皆壁的腔内。脑组织捣毁后，将探针退出，在由枕骨大孔刺入并转向尾方，与脊髓平行刺捻入椎管，以破坏脊髓。椎管较细，故若已刺入椎管针则不能摆动。脊髓被破坏时蛙腿后瞪挺直。要确定脑和脊髓是否完全被破坏可检查蛙四肢肌肉紧张性是否完全消失。
2、 剥制后肢标本
自青蛙两侧腋部以下完全剥离皮肤（注意：可事先剪去尾椎末端及泄殖腔附近的皮肤，使剥离更容易）。而后倒提蛙腿，使其头部向下，用手术间横向剪开腹部肌肉，看清脊神经后，用粗剪刀剪断脊柱（注意勿损伤坐骨神经）。把标本浸泡于盛有任氏液的培养皿中。将手及用过的剪刀、镊子等全部手术器械洗净。
3、 制备坐骨神经-腓肠肌标本
（1）分离两腿。用粗剪刀纵向剪开脊柱（尾扛骨留在一侧）和与两后肢相连的肌肉，再用粗剪刀剪开趾骨联合（为保证两侧坐骨神经完整，应避免剪刀偏向一侧）。将以分离的标本浸入任氏液。 （2）游离坐骨神经。取一条蛙腿，先用玻璃分针沿着脊柱侧游离坐骨神经腹腔部，然后用固定针将标本背位固定于干净蜡盘上。用玻璃分针循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟，纵向分离暴露坐骨神经的大腿部分，直至分离腘窝胫神经分叉处。然后剪断二头肌、半腱肌和半膜肌肌腱，并绕至前方剪断股四头肌腱。自上而下剪断所有坐骨神经分支，将连着3-4节椎骨的坐骨神经分离出来。 （3）分离腓肠肌。用玻璃分针或镊子分离腓肠肌与跟腱，并穿线结扎。在结扎远端用粗剪刀剪断跟腱，左手执线提起腓肠肌，用手术剪减去其周围联系的组织，但保留腓肠肌起始点与骨的联系，注意切勿损伤支配该肌的神经分支。
（4）完成坐骨神经腓肠肌标本。将已游离的坐骨神经搭在腓肠肌上。用粗剪刀自膝关节周围向上剪除并刮净所有大腿肌肉，在距膝关节1cm处剪断股骨。弃去上段股骨，保留部分即为坐骨神经-腓肠肌标本。将标本放入盛有新鲜任氏液的培养皿待用。
（5）标本活性检验。用手术镊轻轻提起标本的脊柱骨片，再用经任氏液润湿的锌铜弓刺激神经。若腓肠肌迅速发生收缩反应，表明标本机能良好，制备成功。应及时移至盛有任氏液的培养皿中待用。
【实验结果】
用锌铜弓检验标本活性，腓肠肌迅速发生收缩反应，标本机能良好，制备成功。
【讨论】
1、制备过程中一定要不断滴加任氏液以防止标本干燥，否则标本可能丧失正常生理活性。
2、操作过程中应避免强力牵拉、手捏神经、夹伤神经肌肉和用金属器械触碰坐骨神经。
3、所用器械要洁净，若接触蛙皮肤需洗净再用。
4、蛙的皮下有淋巴囊，故皮肤很容易剥落。为防止剥离皮肤时滑脱，可用纱布垫着手用力一次剥下。
【思考题】
1、制备坐骨神经-腓肠肌标本时应注意些什么？
答：①动作要轻柔；②不要牵拉神经、手捏神经或夹伤神经肌肉；③尽量避免金属器械触碰神经；④不要把股骨全部剪掉，需要留一段固定标本。
2、锌铜弓为什么可以检测神经肌肉的兴奋性？
答： 通常将金属浸入电解质溶液中，如Zn便溶解而成Zn离子。而在Zn的里面则形成负离子。Cu在溶液中则相反，金属与溶液之间便产生了电位差，即电极电位。如果将Zn和Cu一端接触，则在接触部位电流由Cu向Zn方向流动；而在溶液中则相反，由Zn向Cu流动。当锌铜弓接触组织时（注意：表面必须湿润），电流便沿Zn→可兴奋组织→Cu方向流动，而产生流动作用。这样，锌铜弓好像一个电池，
Zn如同其阳极，Cu好像阴极而发挥作用。神经或肌肉的电刺激阈值非常小，所以仅用锌铜弓接触，即可构成刺激，以便检验组织的机能活性。
3、 剥皮后神经肌肉标本出现的血液能用自来水冲洗吗？
答：不能。原因：①自来水的浓度远小于标本的细胞液浓度，所以会导致标本吸水，可能使得标本吸水涨破；②自来水中可能含有一些金属离子，如Ca2+，会使肌肉抽搐，可能使得标本失去生物活性。
实验内容二 骨骼肌收缩的实验（4-2,4-4）
【实验目的】
1、学习肌肉实验的电刺激方法及肌肉收缩的记录方法。 2、观察刺激强度与肌肉收缩反应的关系
3、 用不同频率的电刺激(最大刺激强度作用于坐骨神经腓肠肌标本，观察刺激频率与收缩反应之间的关系，了解复合收缩的形成过程。
【实验原理】
1、腓肠肌有许多肌纤维组成。刺激腓肠肌时，不同的刺激强度会引起肌肉的不同反应。当刺激强度过小时，不会引起肌肉发生收缩反应，此时的刺激为阈下刺激。当全部肌纤维同时收缩时，则出现最大的收缩反应。这时，即使增大刺激强度，肌肉收缩的力量也不会再随之加大。可以引起肌肉发生最大收缩反应的最小刺激强度为最适刺激强度。
2、不同频率的电脉冲刺激神经时，肌肉会产生不同的收缩反应。若刺激频率较低，每次刺激的时间间隔超过肌肉单次收缩的持续时间，则肌肉的反应表现为一连串的单收缩；若刺激频率逐渐增加，刺激间隔逐渐缩短，肌肉收缩的反应可以融合，开始表现为不完全强直收缩，以后成为完全强直收缩。
【实验器材】
常用手术器械、计算机采集系统、JZ100型张力换能器（100g）、支架、一维位移微调器、肌槽、双凹夹、固定针、锌铜弓、蜡盘、培养皿、废物缸、棉线、纱布、滴管、任氏液。 【实验对象】
蛙的坐骨神经-腓肠肌标本 【实验步骤】
（一） 刺激强度与骨骼肌收缩反应的关系
1、制备坐骨神经-腓肠肌标本，置于任氏液中稳定5-15分钟，以稳定其兴奋性，备用。 2、固定标本
将坐骨神经-腓肠肌标本所带的股骨断端固定于肌槽的骨头固定孔内，腓肠肌肌腱上的扎线与张力换能器金属弹性梁臂上相连，然后将标本的坐骨神经干搭在肌槽的电极上，电极接头与刺激输出线相接，见下图。利用一维位移微调器调节扎线的张力，不可过松或过
紧，使肌肉自然拉平为宜，保证肌肉一旦收缩即可牵动张力换能器的金属弹性梁。
3、实验仪器连接及参数设置
打开计算机采集系统，连接各仪器，选择实验项目“刺激强度与反应的关系”。调节刺激延时至最小，波宽为1ms，选择强度递增的刺激方式进行刺激。放大倍数一般设为10-20倍或灵敏度30g/div，滤波频率为100Hz，扫描频度1.0s/div（放大倍数、滤波频率及扫描速度可根据实验标本不同具体设置，延时设为最小）
4、 实验观察
（1）启动刺激图标，观察肌肉收缩反应。如果肌肉无收缩反应，则适当增加刺激强度，其他刺激参数保持不变。间隔少许时间，重复进行刺激，直到出现肌肉的最小收缩。测量收缩幅度并记下刺激强度，此时的刺激强度位阈强度。
（2）逐渐增加刺激强度，观察刺激强度与肌肉收缩反应的关系。
（3）当刺激强度达到某一数值后，肌肉收缩幅度不再随刺激强度的增加而升高。记录此时的收缩刺激强度。 （二）刺激频率与骨骼肌收缩反应的关系 1、实验仪器用品的准备 同实验内容二（一）的准备。
2、打开计算机采集系统，连接各仪器，选择实验项目“刺激频率与反应的关系”。调节刺激的延时、波宽至最小，放大倍数一般设为10-20倍，滤波频率为100Hz。 3实验观察
强直收缩：用“连续刺激”方波刺激坐骨神经腓肠肌标本，改变电刺激频率，观察不同频率的阈上刺激引起肌肉收缩形式的变化。刺激的波宽和电压强度调到最适刺激强度，保持此参数不变，每次给刺激仅改变连续刺激方波的频率。分别记录不同频率时的肌肉收缩曲线。观察不同刺激频率时肌肉收缩形式的变化。 【实验结果及结论】
（一）刺激强度与骨骼肌收缩反应的关系 结果：
1、腓肠肌标本刺激强度与骨骼肌收缩反应的关系如附：图1所示。其中，阈刺激强度为0.035V，最适刺激强度为0.125V。最大反应的收缩幅度为17.33g。
2、将图1中的峰值连接起来成为一条平滑的曲线，大致形状如下图：
17.33
0.035 0.125
结论：当给予阈下刺激时，不能引起肌肉收缩反应； 当给予阈刺激时，引起肌肉的最小收缩；
当给予的刺激强度由阈刺激至最适刺激逐渐增加时，肌肉的收缩反应随之升高；
当给予的刺激强度达到最适刺激后，肌肉的收缩幅度不再随刺激强度的增加而升高。
（二） 刺激频率与骨骼肌收缩反应的关系
结果：腓肠肌标本刺激频率与骨骼肌收缩反应的关系如附：图2所示。其中，频率<6.0Hz时，腓肠肌进行单收缩，收缩幅度小； 7.0Hz<频率<18.0Hz时，腓肠肌进行不完全强直收缩，收缩幅度较单收缩大；
频率>19.0Hz时，腓肠肌进行强直收缩，收缩幅度很大。 结论：
1、随刺激频率的增大，骨骼肌分别进行单收缩、不完全强直收缩、强直收缩，后二者是新的收缩过程与上次尚未结束的收缩过程发生综合的结果。
2、单收缩、不完全强直收缩、强直收缩三者中强直收缩的收缩幅度最大，不完全强直收缩其次，单收缩再次，可以表明三种收缩所能发出的力量为强直收缩>不完全强直收缩>单收缩。 【讨论】
1、在“刺激强度与收缩反应的关系”实验中，当刺激强度达到最适刺激强度后，已经引起肌纤维同时收缩，所以再增大刺激强度，肌肉收缩幅度不再增大。
2、在观察“刺激频率与反应的关系”时，每次肌肉收缩后应让肌肉休息后再做下一次刺激，因为肌肉在连续受刺激后会产生肌肉疲劳，这是因为肌肉内部储存的能量有限的缘故。如果不许休息肌肉可能因此产生痉挛或失去活性。
3、固定标本时，悬线松紧应合适，防止前负荷造成影响。 4、在整个实验过程中（包括标本制作和实验）应不断的用任氏液润湿标本从而使标本保持活性，防止标本干燥而失火。
5、在不正式记录时应将电子刺激器输出端断开防止不必要的刺激。
6、肌肉若出现痉挛，可能是漏电原因引起的，也可能是空气流动快引起的，应注意检查电路、关窗。
7、在附：图2中，频率为4.0Hz时的单收缩幅度要大于频率为7.0Hz的不完全强直收缩，可能原因是给予的刺激强度过大。应当将刺激强度调为最适刺激强度为好。 【思考题】
1、同一标本的阈刺激强度与最适刺激强度是否会发生变化？为什么？ 答：同一标本的阈刺激强度和最适刺激强度会发生变化。因为随着标本离体时间的增加，它的兴奋性会发生变化，所以会发生变化。 2、连续电刺激神经，为何容易产生肌肉疲劳？
答：肌肉收缩的机制是肌纤维相对滑动,当横桥与细肌丝结合时,横桥行使ATP酶的功能,消耗ATP使肌丝间滑动,所以肌肉收缩是一个消耗能量的过程,而肌肉内储存的ATP是有限的,所以长时间的收缩会使肌肉疲劳。
3、分析讨论肌肉发生收缩总和的条件与机制。 答：条件：后一次刺激落入前一次刺激的收缩期内。
机制：若后一次刺激落入前一次刺激的绝对不应期内，则不会有动作电位产生，所以不会产生二次收缩的任何反应，若后一次刺激落入前一刺激的相对不应期内，会产生一次较弱的二次兴奋，致使终池释放较多的Ca2+从而产生一次较强的肌肉收缩。
4、分析讨论不完全强直收缩和完全强直收缩的条件与机制。
答：当一串刺激作用于肌肉时，若后一次刺激落入前一次刺激的舒张期内，则会使肌肉再一次收缩后，还未完全舒张就发生另一次刺激，这就是不完全强直收缩。
后一次刺激（如果频率足够高时，也可能是后几次刺激）落入前一次刺激的收缩期内，则前后的刺激产生的收缩发生融合，使得肌肉的收缩力显著增大并持续表现为收缩状态，从而产生强直收缩。
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