甘蔗不同部位宿根矮化病分子检测研究

中　国　糖　料　２０１３钷　第４期　Ｓｕｇａｒ　Ｃｒｏｐｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　文章编号：１００７—２６２４（２０１３）０４—００２７—０２　甘蔗不同部位宿根矮化病分子检测研究　张荣跃，单红丽，王晓燕，尹炯，申科，罗志明　（云南省农业科学院甘蔗研究所／云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远６６１６９９）　摘　要：运用ＰＣＲ检测技术对粤糖９３—１５９和ＲＯＣ２５的不同部位进行了ＲＳＤ检测，结果表明，在同一个样品的５　次重复检测中，两个品种叶片的平均检出率为２０％，叶鞘的平均检出率为９０％，茎尖的平均检出率为４０％，茎部组织　和蔗汁的平均检出率均为１００％。本研究表明今后可以使用甘蔗茎部组织或叶鞘代替蔗汁进行ＲＳＤ的检测。　关键词：甘蔗；宿根矮化病；ＰＣＲ检测　中图分类号：￥４３５．６６１　文献标识码：Ａ　甘蔗宿根矮化病（Ｒａｔｏｏｎ　Ｓｔｕｎｔｉｎｇ　Ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＳＤ）是一种世界性的重要甘蔗病害，由一种寄居木质部的细　菌（　ｅ蜘ｏｎｉａ　ｘｙｌｉ　ｓｕｂｓｐ．　，Ｌｘｘ）引起ｌ１】。蔗株染病后矮化，分蘖减少，蔗茎变细，节问缩短，一般减产１２％～　３７％．蔗糖分降低０．５个百分点［２１。ＲＳＤ没有明显的外部和内部症状，从外观难以鉴定，从而导致病害广泛蔓　延传播。该病主要通过带病蔗种和收获、砍种刀具等传播蔓延，且传播性极强　，目前有效的防治方法是生　产、繁殖和推广脱毒健康种苗。　目前我国对甘蔗宿根矮化病菌的检测方法主要使用ＰＣＲ检测法。由于Ｌｘｘ主要寄生于蔗株维管束组　织．所以ＰＣＲ检测ＲＳＤ主要使用甘蔗汁．但使用甘蔗汁检测ＲＳＤ取样和取汁程序比较繁琐，而且榨汁过程　容易污染．并且对于甘蔗苗期和组培苗等无法取汁进行检测，有其局限性，采用甘蔗其它部位检测ＲＳＤ可避　免这些情况。本文采用常规ＰＣＲ方法对甘蔗不同部位进行了多次重复检测，比较了甘蔗不同部位与蔗汁检　测ＲＳＤ的准确率．为今后使用甘蔗其它部位检测ＲＳＤ提供科学数据。　１材料与方法　１．１样品采集　供试样品采自于云南省农业科学院甘蔗研究所第二科研基地脱毒种苗试验对照．株龄１０个月，品种为　粤糖９３—１５９和ＲＯＣ２５．每个品种随机取样３株，每株取不同部位（叶片、叶鞘、茎尖、茎部组织）和蔗汁　，３　株同一品种甘蔗的同一部位混合成一个样品．置于一２０￣Ｃ保存备用。　１．２　ＰＣＲ检测　１．２．１甘蔗总ＤＮＡ提取甘蔗样品用液氮磨成粉末，取约０．３ｇ于１．５ｍＬ离心管中，立即加入１０００　Ｌ　６５℃　预热的２％ＣＴＡＢ提取液．６５℃水浴ｌｈ，期间颠倒离心管数次；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，加入等体积　氯仿：异戊醇（２４：１），充分混匀；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，加入２／３体积的异丙醇，混匀后置于一２０℃　沉淀２ｈ；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，沉淀用７０％乙醇洗涤２次，室温风干，溶于３０１￣Ｌ　ｄｄＨ　０中，一２０℃　保存备用　１．２．２蔗汁ＤＮＡ的提取取４ｍＬ蔗汁．１２０００ｒ／ｍｉｎ４￣Ｃ离心１５ｍｉｎ，弃上清，沉淀加３００ｔｘＬ灭菌双蒸水混匀：加　入６００１￣Ｌ经６５℃预热的２％ＣＴＡＢ提取液，６５￣（２水浴１ｈ，期间颠倒离心管数次；加入６００￣Ｌ氯仿／异戊醇（２４：１）　充分混匀。１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ：取上清，加入２／３体积的异丙醇，混匀后置于－２０℃冰箱中沉淀２ｈ；１２０００ｒ／ｍｉｎ　离心１０ｍｉｎ，弃上清，沉淀用７０％７￣醇洗涤２次，室温风干后，溶于３０１ｘＬ　ｄｄＨ２０中，一２０￣Ｃ保存备用。　１．２．３　ＰＣＲ扩增引物序列采用文献ｆ５１报道的ＲＳＤ病原细菌Ｌｘｘ　１６Ｓ～２３ＳｒＤＮＡ基因间隔区特异引物，委　托上海生工生物技术有限公司合成．预期扩增产物长度为４３８ｂｐ。其序列为：　上游引物Ｌ）【ｘｌ：５　一ＣＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡｑＴＧＡＣＣ一３　下游引物Ｌ】【ｘ２：５　一ＡＣＣＣＴＧＴＧＴｒＧ唧ＣＡＡＣＧ一３　ＰＣＲ反应体系（２Ｏ　Ｌ）包括２ｘＰＣＲ　Ｔａｑ　Ｍａｓｔｅｒ　８　Ｌ，Ｃｘｘ１和Ｃｘｘ２各０．２卜ＬＬ，ｄｄＨ２０　８．６　Ｌ，ＤＮＡ　３　Ｌ。　ＰＣＲ扩增程序：９５℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５６ｑＣ　３０ｓ，７２℃ｌｍｉｎ，３５个循环，７２℃５ｍｉｎ。　２结果与分析　采用常规ＰＣＲ检测方法对粤糖９３—１５９和ＲＯＣ２５的叶片、叶鞘、茎尖、茎部组织和蔗汁样品分别进行了　收稿日期：２０１３—０６—２７　基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（ＣＡＲＳ一２０—２—２）；云南省现代农业产业技术体系建设专项资金资助。　作者简介：张荣跃（１９８２一），男，研究实习员，主要从事甘蔗病害研究。Ｅ－ｍａｉｈ　ｒｏｎｇｙｕｅｚｈａｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。　第４期　霍秀娟，等：广西部分甘蔗品种对黑穗病的抗性测定　３１　种Ｆ１３４．并成为主栽品种。抗病品种长期单一化种植，黑穗病菌２号小种成为优势小种而导致Ｆ１３４抗性丧　失，引起大面积的黑穗病流行　这也是桂糖ｌ１、台糖１６和台糖２２等甘蔗品种经大力推广种植后，甘蔗黑穗　病Ｅｔ趋严重的主要原因之一　３个对照品种。包括ＮＣ０３１０、Ｆ１３４和ＮＣＯ３７６，是中国台湾地区甘蔗黑穗病菌生理小种鉴别寄主，其中，　ＮＣ０３１０对甘蔗黑穗病菌１号小种感病．Ｆ１３４对甘蔗黑穗病菌２号小种感病，ＮＣＯ３７６对甘蔗黑穗病菌１号　和２号小种均免疫。在本试验中．人工接种条件下，Ｆ１３４的平均发病率为３６．１２％，ＮＣ０３１０的平均发病率为　３８．６８％．说明本试验采用的混合冬孢子中包含甘蔗黑穗病菌１号小种和２号小种；ＮＣＯ３７６平均发病率　４．８９％。抗性级别是２级，抗性类型为抗病（Ｒ），说明本试验所采用的混合冬孢子中可能出现了除１号小种和　２号小种以外的其他小种或者毒性变异菌株。导致原免疫品种ＮＣＯ３７６发病。由此推测广西蔗区可能存在３　个或者３个以上的甘蔗黑穗病菌生理小种．３号小种可能是随着新台糖系列甘蔗品种在广西推广而被引入　广西蔗区的［２１。　参考文献：　『１１廖咏梅，王忠文．广西甘蔗病害的发生现状及其防治策略『Ｊ１．广西植保，１９９９（２）：２５—２６．　『２］韦昌联．广西蔗区新台糖２２号种性退化现状分析及对策措施『Ｊ１．南方农业学报，２０１２，４３（１２）：２１１３—２１１７．　『３１张琼．粤、桂、滇蔗区甘蔗品种更替概况『Ｊ１．甘蔗糖业，２００７（６）：８－１３．　『４１林清山，王建南．甘蔗品种与黑穗病菌的互作分析『Ｊ］．甘蔗，１９９６，３（１）：５－９．　『５１夏红明，陈学宽，范源洪，等．甘蔗优异育种材料的抗黑穗病鉴定ｆＪ１．甘蔗，２００３，１０（３）：５－７．　『６１夏红明，吴才文，陈学宽，等．甘蔗材料的黑穗病抗性鉴定ｌＪＩ．中国糖料，２００７（３）：２６—２７．　『７１陈庭俊，林一心．抗黑穗病甘蔗优异育种材料的鉴定『Ｊ］．甘蔗糖业，２００１（４）：９—１１，１７．　『８１谭芳，黎焕光，杨荣仲．优良甘蔗新品种（系）抗黑穗病鉴定试验研究初报ｆＪ１．广西蔗糖，２００６（４）：７－９，２９．　『９１黄家雍，何红，闭少玲，等．抗黑穗病甘蔗优良品系的筛选［Ｊ】．广西蔗糖，２００１（１）：６－８．　ｆ１Ｏ］沈万宽，邓海华．引进甘蔗品种黑穗病抗性鉴定及结果分析［Ｊ】．中国农学通报，２０１１（１９）：２３４—２３８．　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｅｖｅｒａｌ　Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｓｍｕｔ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｇｕａｎｇｘｉ　ＨＵ０　Ｘｉｕ—ｉｕａｎ　，ＬＩ　Ｃｈａｏ—ｓｈｅｎｇ　，ＬＵ　Ｒｏｎｇ—ｓｈｅｎｇ　，０　（　．Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００７，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ａ　ｃａｄｅｍｙ　ｆＡｇｒｉｏｃｕｈｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００７，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆＢｉｏｏｌｏｇｙｆｏｒ　Ｃｒｏｐ　Ｄ　ｅ∞ｅｓ　ａｎｄ　Ｉｓｅｃｔｎ　Ｐｅｓｔｓ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００７，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ　ｍｉｘｅｄ　ｓｐｏｒｅｓ　ｏｆ　Ｕｓｔｉｌａｇｏ　ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ　Ｓｙｄｏｗ　ａｓ　ｔｈｅ　ｉｎｏｃｕｌｕｍ，ｓｍｕｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　７　ｍａｉｏｒ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｂｙ　ｄｉｐｐｉｎｇ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ａ　ｎｅｗ　ｐｌａｎｔ　ｆｉｅｌｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｙｕｅ９３／１５９，Ｇｕｉｔａｎｇ９４／１　１６　ａｎｄ　ＲＯＣ２５　ｗｅｒｅ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｓｍｕｔ，ＲＯＣ１０　ａｎｄ　ＲＯＣ　１６　ｗｅｒｅ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ｔｏ　ｓｍｕｔ．ＲＯＣ２２　ａｎｄ　Ｇｕｉｔａｎｇｌ　１　ｗｅｒｅ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ｔｏ　ｓｍｕｔ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｐｒｅｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　３　ｏｒ　ｍｏｒｅ　ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ｕｓｔｉｌａｇｏ　ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ　ｉｎ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｘｉ　ｃａｎｅ　ａｒｅａ，Ｃｈｉｎａ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｕｇａｒｃａｎｅ；ｓｍｕｔ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ　ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ　Ｓｙｄｏｗ）；ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　（上接第２８页）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　Ｒａｔｏｏｎ　Ｓｔｕｎｔｉｎｇ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｐａｒｔｓ　ｏｆ　Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ＺＨＡＮＧ　Ｒｏｎｇ－ｙｕｅ，ＳＨＡＮ　Ｈｏｎｇ－ｌｉ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｙａｎ，ｒＩＮＧ　Ｊｉｏｎｇ，ＳＨＥＮ　Ｋｅ，ＬＵＯ　Ｚｈｉ—ｍｉｎｇ　（Ｓｕｇａｒｃａｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｓｔｎｉｔｕｔｅ，Ｙｕｎｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆａｇｒｉｃｕｈｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｙｕｎｎａｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒｔｏｒａｙ　ｏｆＳｕｇａｒｃｎｅａ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｋａｉｙｕａｎ　６６１６００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰＣＲ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　Ｒａｔｏｏｎ　ｓｔｕｎｔｉｎｇ　ｄｉｓｅａｓｅ（ＲＳＤ）ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｒｔｓ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ＹＴ９３—１５９　ａｎｄ　ＲＯＣ２５．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ。ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｌａｄｅ，ｓｈｅａｔｈａ　ｓｔｅｍ　ｔｉｐ　ｗｅｒｅ　ａｔ　２０％，９０％，　４０％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｊｕｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ａｔ　１　００％ｉｎ　ｔｈｅ　５　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｓａｍｅ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｐｒｏｖｅｄ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ｓｔｅｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏｒ　ｓｈｅａｔｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ＲＳＤ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｓｔｅａｄ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ　ｊｕｉｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｕｇａｒｃａｎｅ；ｒａｔｏｏｎ　ｓｔｕｎｔｉｎｇ　ｄｉｓｅａｅ；ＰＣＲ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ