[12]发明专利申请公布说明书
[21]申请号200810230877.4
[51]Int.CI.
C12Q 1/04 (2006.01)
[43]公开日2010年2月17日[22]申请日2008.11.14[21]申请号200810230877.4
[71]申请人河南工程学院
地址451191河南省新郑市龙湖中山北路1号[72]发明人张建云 崔树军 谷立坤 廉有轩 金维平
[11]公开号CN 101649347A
权利要求书 1 页 说明书 3 页
[54]发明名称
一种筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法
[57]摘要
本发明涉及毕赤酵母基因工程菌株的筛选方法，属于基因工程领域。具体内容是关于毕赤酵母高拷贝数转化子的快速筛选方法。本发明利用自制G418浓度梯度平板进行重组毕赤酵母高拷贝数转化子的筛选。该方法可以用1个筛选平板代替传统方法中10个不同浓度的筛选平板，使筛选工作效率大大提高，对筛选用的抗生素G418的用量降低了80％以上，降低了技术成本。而且，本方法可以提供连续的抗生素浓度梯度，弥补了传统筛选方法中抗生素筛选梯度不连续而造成重要高抗性转化子被遗漏的缺点。本方法可广泛应用于毕赤酵母表达系统的高拷贝数重组转化子的筛选。
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权 利 要 求 书
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1.一种新型的筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法，本发明的特征在于： (1)自制了一种新型的、特殊的G418斜面浓度梯度筛选平板。
(2)以步骤(1)的得到的G418斜面浓度梯度筛选平板，用于筛选含有高拷贝数外源基因的毕赤酵母转化子。
2.按照权利要求1中所述的新型的筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法的应用。其特征在于筛选中使用了G418的斜面浓度梯度平板。
3.按照权利要求1中所述的新型的快速筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法。其特征在于G418的斜面梯度平板制作过程中，上层培养基中使用了不含G418的培养基，下层培养基中使用了含有一定浓度的G418，G418的浓度范围在0mg/ml到100mg/ml之间。 4.按照权利要求1中所述的新型的快速筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法。其特征在于G418的斜面梯度平板制作过程中，下层含有一定浓度G418的培养基在凝固之前制成了斜面平板，其斜面与水平面的倾斜角度在0°到90°之间。
5.按照权利要求1中所述的新型的快速筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法。本筛选平板制备过程中所使用的容器不限于90mm培养皿，可以为任何类似的容器。 6.按照权利要求1中所述的新型的快速筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法。本筛选方案可适用于任何类型的毕赤酵母的宿主菌(GSII5，KM71，SMD1168，SMD1163) 7.按照权利要求1中所述的新型的快速筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法。本筛选方案可适用于任何类型的毕赤酵母的表达载体(PIC9K，PIC3.5K，PIC9)
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说 明 书
一种筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法
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技术领域：
本发明涉及毕赤酵母基因工程菌的筛选方法，具体内容是关于毕赤酵母高拷贝数转化子的快速筛选方法，属于基因工程领域。技术背景：
分子生物学技术的发展为利用生物反应器生产外源蛋白提供了许多方法和手段。到目前为止，已发展出了大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种蛋白表达系统，毕赤酵母(Pichia.pastoris)基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等400多种外源蛋白，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜于扩大为工业规模。
利用毕赤酵母表达外源基因一般包括以下步骤：①将外源基因插入毕赤酵母表达载体；②用内切酶处理线性化的重组质粒转化毕赤酵母菌株；③将转化物接种HIS4营养缺陷平板进行阳性重组子的首轮筛选；④用G418梯度平板进行阳性重组子的第2轮筛选；⑤进一步确定外源基因在酵母基因组中的整合情况；⑥小规模诱导培养鉴定外源基因的表达；⑦大规模诱导培养制备重组蛋白。为了提高外源基因在毕赤酵母中的表达量，通常需要筛选含高拷贝数外源基因的毕赤酵母转化子，而高拷贝数转化子的筛选是通过利用提高G418抗性来完成的。(在毕赤酵母常用的系列表达载体PIC9K，PIC3.5K，PIC9中，引入了G418抗性标记基因。转化完成后，外源基因和抗性基因以同源重组的方式同时整合到毕赤酵母染色体上。通过提高G418的抗性，可以筛选到多拷贝数插入的外源基因)
为了筛选到高拷贝数的阳性克隆子，需要用不同浓度梯度的G418平板进行筛选，常用的G418浓度梯度有0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0mg/ml.invitrogen公司的protocol上介绍了两种筛选方案。第一种方法是制备不同浓度梯度的G418平板，用影印的方法将HIS4营养缺陷平板上的阳性克性克隆子逐一影印到G418梯度平板上进行高拷贝数克隆子的筛选。这种方法的特点是工作量大(在影印之前还需连续转接培养3次，以保证影印时每个单克隆子的浓度相当)，筛选难度高，周期长，而且筛选的克隆子数相对较少；第二种方法同样需要制备不同浓度梯度的G418平板，不同的是可以用无菌水或培养基将HIS4营养缺陷平板上的全部阳性克隆子洗下来，稀释到合适的浓度，取一定量分别涂到G418浓度梯度平板上，这样的操作相对简单，能筛选的克隆子较多，但需要预先做菌体稀释。这两种筛选方案是目前国内外科技工作者利用毕赤酵母表达系统表达外源蛋白时使用的通用筛选方法。从上述介绍可以看出，这两种筛选方案各有利弊，但是它们共同的缺点就是需要配制10种不同浓度梯度的G418筛选平板，G418的用量大，操作繁琐，工作量大，费时费力。
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发明内容：
针对以上两种筛选方案共同存在的弊端，本发明提供了一种操作简单，结果可靠，节约成本的快速筛选毕赤酵母高拷贝数转化子的方法。
本发明的核心内容：用自制的G418筛选平板进行毕赤酵母高拷贝数转化子的筛选，可以达到用1个平板代替10个不同浓度梯度G418平板进行筛选的目的。其优点如下： 1)简化工作程序，缩小工作量。利用1个平板进行筛选就可以达到用10个平板进行筛选的效果，提高工作效率。
2)节约成本，提高筛选工作的性价比。毕赤酵母高拷贝数基因工程菌筛选过程中用到的G418价格在400元/克。使用新型筛选平板可以使G418的用量节约80％以上，极大的降低了技术成本。
3)本筛选平板所涵盖的浓度梯度范围更广。毕赤酵母转化子拷贝数越高，抗G418的能力越强。但是高抗性的转化子数目较少，为了能够尽量多的筛选到较高抗性的转化子，protocol要求做10个不同浓度梯度的G418抗性平板，但不同浓度之间的空白区可能会造成筛选过程中的遗漏。(比如3.5mg/ml的抗性的转化子就可能会在筛选过程中被漏掉。)而本发明中特制的平板能够形成连续的浓度梯度，不会造成筛选过程中高抗性转化子被遗漏的现象。
G418斜面浓度梯度平板的制作流程及原理如下(以最高浓度为4.0mg/mlG418的斜面浓度梯度平板为例)：
1)取G418的贮存液(100mg/ml)400ul加入到加到事先融化好的10mlYPD固体培养基中(培养基温度在45-55度之间)，混匀，使培养基中G418的终浓度达到4.0mg/ml，倒入培养皿中。(本筛选平板制作时用的为90mm培养皿)
2)在培养基凝固前，将培养皿中的培养基摆成斜面(斜面与水平面之间的角度在20度到30度之间)，待斜面培养基冷却凝固好以后做好标记，倒入10ml不含G418的上层YPD培养基。(倒的时候要注意温度的控制，以防温度过高损坏下层的斜面培养基)。 3)双层培养基冷却凝固后，可以得到最高浓度为4.0mg/ml，最低浓度为0mg/ml的G418浓度梯度平板。(由于扩散作用，下层培养基中的G418会向上层培养基中均匀扩散，而上层不含抗生素的培养基在各个纵切面上的厚度呈连续梯度分布，这就使G418在双层平板的表面形成了连续的浓度梯度。)
本发明所述的G418斜面浓度梯度平板的在制备过程中不限于最高浓度为4.0mg/ml的G418，可以为任何浓度范围的G418斜面浓度梯度梯度平板；另外，所用的底层培养基和上层培养基的量以及所形成的斜面角度均不受上述描述所限制，一般情况下，培养基用量大，所形成的斜面角度越大；最后，本筛选平板制备过程中所使用的容器不限于90mm培养皿，可以为任何类似的容器。 具体实施方式：
(以在毕赤酵母GS115中表达外源基因pon1的筛选为例) 1毕赤酵母重组表达载体的构建
将本实验室保存的pPUC-18-pon1重组质粒进行双酶切，并于毕赤酵母表达载体pPIC9K进行连接构建重组表达载体pPIC9K-pon1(pon1为1068bp的外源基因)。 2重组质粒的线性化及电转化
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200810230877.4说 明 书 第3/3页
将重组表达载体pPIC9K-pon1进行线性化并且电转化至毕赤酵母GS115(组氨酸营养缺陷型)中。
3组氨酸营养缺陷型初次筛选
用组氨酸营养缺陷型MD平板(1.34％YNB，4×10
-5
生物素，0.5％甲醇，1.8％琼脂)进行
初次筛选，只有重组表达载体整合到GS115的染色体上的菌株才能在MD平板上正常生长。 4G418斜面浓度梯度平板进行二次筛选
取G418的贮存液(100mg/ml)适量加入到加到事先融化好的YPD固体培养基(2％蛋白胨，2％葡萄糖，1％酵母提取物)中，混匀，使培养基中G418的终浓度达到4.0mg/ml，在培养基凝固前，将培养皿中的培养基摆成斜面，待斜面培养基冷却凝固好做好标记，倒入等量不含G418的上层YPD培养基。双层培养基冷却凝固后，可以得到最高浓度为4.0mg/ml，最低浓度为0mg/ml的G418浓度梯度平板。
将MD平板上初筛到的转化子用2ml无菌水冲洗下来，稀释至的10
-5
，10
-6
，10
-7
三个浓度
梯度，每个梯度取100ul加到G418斜面浓度梯度平板中(每个梯度涂3个)，30度过夜培养2天，观察结果。
5PCR验证进一步确定外源基因在酵母基因组中的整合情况
挑选G418斜面浓度梯度平板上较高浓度区域的生长快速的转化子，以pPIC9K上的aox引物对其进行菌液PCR验证，其中甲醇利用快型即mut+的得到的是两条带分别是2200bp和1068bp的目的条带；甲醇利用慢型即muts得到的只有一条大小为1068bp目的条带，而假阳性得到的只有一条500bp的条带。
6根据实验所需，可以分别选取甲醇利用快型即mut+或甲醇利用慢型即muts型的转化子进行后续的诱导试验。
本研究采用G418斜面浓度梯度平板的制备，可以用1个平板来代替protocol中所提到的10个浓度梯度平板，而且其所涵盖的浓度梯度范围更广。实践证明，该发明不但可以方便快捷地筛选到高浓度抗性的克隆子，提高工作效率，而且还可以大大节约G418的用量，降低技术成本，是一种非常有效的筛选方案。
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