(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111788991 A(43)申请公布日 2020.10.20
(21)申请号 202010756859.0(22)申请日 2020.07.31
(71)申请人 中国林业科学研究院林业研究所
地址 100091 北京市海淀区东小府1号(72)发明人 白永超 裴冬 张俊佩 马庆国 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 赵静(51)Int.Cl.
A01G 18/00(2018.01)A01G 18/60(2018.01)A01G 18/69(2018.01)A01G 17/00(2006.01)A01G 9/24(2006.01)A01G 9/18(2006.01)
权利要求书3页 说明书9页 附图1页
A01G 9/14(2006.01)A01G 7/06(2006.01)G01N 27/62(2006.01)C05G 1/00(2006.01)C05G 5/20(2020.01)
CN 111788991 A(54)发明名称
一种同位素C-N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的方法和装置(57)摘要
本发明公开了一种同位素13C‑15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的方法和装置。本发明是关于植物‑微生物共生关系研究的方法和装置，它属于一种通过同位素标记试验定量分析微生物促进宿主吸收矿质元素的方法。本发明以不同孔径的尼龙网和有机玻璃板组装的一体化装置为工具标记同位素13C‑15N来定量分析内生真菌与宿主植物互惠共生关系。本方法充分利用了一体化装置快速、准确以及可控性强的特点，在同一棵树体中进行多种同位素同时标记，快速揭示了内生真菌与宿主植物间的相互作用。本发明实现了内生真菌与宿主植物互惠共生关系研究的一体化标记装置，解决了定量分析内生真菌功能特性的问题，大大提高了同位素标记效率和标记精度。
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权 利 要 求 书
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1.一种同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的装置，包括：箱体，所述箱体内部从左到右依次设置N标记室、中间部分、N标记室；所述中间部分从前到后依次设置具有标记的真菌室I、植物生长室、具有标记的真菌室II；所述两个N标记室分别均匀分为4个N标记室，即NⅠ,NⅡ,NⅢ,NⅣ，NⅠ′,NⅡ′,NⅢ′,NⅣ′；
隔离层，设于植物生长室与N标记室和具有标记的真菌室I、II及N标记室与具有标记的真菌室I、II的接触面，用于分隔N标记室、具有标记的真菌室和植物生长室；
所述隔离层包括：有机玻璃板、2mm尼龙网或20μm尼龙网；所述有机玻璃板设于所述箱体底部至高15cm以上的隔离层，所述2mm尼龙网和20μm尼龙网，设于所述箱体底部至高15cm以下的隔离层；
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C气体反应发生装置，设于所述植物生长室，用于生成13C-CO2气体进行13C标记；所述1313C气体反应发生装置包括：带胶塞废液排放管，用于排放反应废液；C-CO2反应杯，用于盛放13C-Na2CO3溶液；带刻度三通阀滴定管，设于13C-CO2反应杯16的上方，所述带刻度三通阀滴定管中的三通阀设于箱体顶部，通过三通阀向所述13C-CO2反应杯中注入HCl溶液与13C-Na2CO3溶液反应生成13C-CO2气体进行13C标记；
气体传感器，设于所述植物生长室，用于监测13C标记前后及标记过程中的CO2和O2浓度；日光灯，设于植物生长室；带胶塞广口瓶组件，设于植物生长室，用于吸收13C标记前后的CO2气体；所述带胶塞广口瓶组件包括：带胶塞广口瓶，用于盛放碱性溶液充分吸收植物生长室中的CO2气体；挂钩，设于植物生长室的顶部，用于固定带胶塞广口瓶中的胶塞；
温湿度计，设于植物生长室，用于监测植物生长室中的温度和湿度；温控组件，连通箱体内部，用于调节植物生长室中的温湿度；所述温控组件包括：冷却管，设于植物生长室，用于调节植物生长室温湿度；冷水发生器，设于箱体外侧，用于制冷控温水；气泵，设于箱体外侧，用橡胶软管连接冷却管和冷水发生器，用于将冷水发生器中的控温水泵入冷却管。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述箱体由有机玻璃制成，所述箱体顶部的有机玻璃板只密封所述植物生长室，所述N标记室、具有标记的真菌室I、具有标记的真菌室II敞口或透气不密封；
所述植物生长室顶部右侧设置带把手箱门；所述带把手箱门使用橡胶垫片密封，关闭时不会漏气。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于：所述13C气体反应发生装置中，所述13C-CO2反应杯放置在所述植物生长室左侧，所述13C-CO2反应杯的底部安装一根带胶塞废液排放管，通过NⅡ穿过箱体壁至箱体外；
所述箱体的箱壁与所有导管穿过处均使用防水胶进行密封，以保证箱体严格密封。4.根据权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于：所述箱体的长×宽×高为40×40×50cm；所述N标记室的尺寸为10×40cm，所述NⅠ、NⅡ、NⅢ、NⅣ，NⅠ′、NⅡ′、NⅢ′、NⅣ′标记室的尺寸均为10×10cm；所述具有标记的真菌室Ⅰ和具有标记的真菌室Ⅱ的尺寸均为20×10×50cm，植物生长室的尺寸为20×20×50cm。
5.利用权利要求1-4中任一所述装置研究同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的方法，包括下述步骤：
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权 利 要 求 书
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(1)基质准备：称取经高温连续灭菌3次的基质装入洁净的植物生长室、N标记室和具有标记的真菌室；每个室基质厚度均为20-25cm，基质厚度超出尼龙网隔离层高度5-10cm，使得上述各分隔室相对密封不透气；
(2)待标记幼苗移栽：选取苗龄20d-30d的实生幼苗，截断主根后移栽至植物生长室中，每个植物生长室一棵幼苗，将权利要求1-4中任一所述装置所述装置放置于日光能温室或自然环境中，移栽后在所述植物生长室、N标记室和具有标记的真菌室中浇灌无菌水，使基质含水量在60±5％，幼苗成活后每隔7d在N标记室浇灌1/2Long-Ashton medium营养液，在21d时将1/2Long-Ashton medium营养液替换为缺N的1/2Long-Ashton medium营养液，其它元素不变，浇灌时间仍为7d一次，营养液浇灌直到同位素标记试验结束；植物生长室和具有标记的真菌室不浇灌营养液，以促进根系或菌丝透过尼龙网吸收养分；
(3)建立共生体系：将具有标记的内生真菌等量接种于20μm尼龙网和2mm尼龙网分隔的无菌的具有标记的内生真菌室I和具有标记的内生真菌室Ⅱ，若干天后检测苗木根系中是否具有携带标记的内生真菌，并观察标记的内生真菌在植物根系中的定殖部位及其侵染率，若成功定殖根系后，开始同位素13C-15N标记；
(4)同位素15N标记：在15N标记前，对待标记幼苗进行N饥饿处理1周，使用改良的缺N的1/2Long-Ashton medium营养液正常浇灌，一周后在箱体左侧的4个N标记室NⅠ,NⅡ,NⅢ,NⅣ中加入等量的同位素15N，在箱体右侧的4个氮标记室NⅠ′,NⅡ′,NⅢ′,NⅣ′中加入等量的同位素15N开始标记，N标记室中的同位素15N浓度均为1mM，开始标记后正常浇灌缺N的1/2 Long-Ashton medium营养液，其它元素不变，浇灌时间为7d一次，，持续标记7-10d后进行同位素15N丰度检
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测，取样时使用无菌水调节基质含水量在60±5％，N丰度采用同位素质谱仪进行测定，然后计算标记植株中硝态氮(或铵态氮)的百分含量；计算公式为：
硝态氮(或铵态氮)(％)＝[测定样品15N丰度(％)-自然界15N丰度(％)]/10.2％，自然界中15N丰度约为0.336％；其中，内生真菌帮助宿主吸收15NO3-的量为NⅠ和NⅡ标记室消耗的量，宿主根系吸收15NO3-的量为NⅢ和NⅣ标记室消耗的总量减去NⅠ和NⅡ标记室消耗的总量；内生真菌帮助宿主吸收15NH4的量为NⅢ′和NⅣ′标记室消耗的量，宿主根系吸收15NH4的量为NⅠ′和NⅡ′标记室消耗的总量减去NⅢ′和NⅣ′标记室消耗的总量；
(5)同位素13C标记：每天标记时间从上午09：00至下午17：00结束，标记前使用广口瓶中的碱性溶液充分吸收植物生长室中的CO2气体，并使待标记苗木碳饥饿处理一天，以此提高同位素13C标记效率；标记前，通过13C气体反应发生装置使13C-碳酸钠溶液与盐酸反应生成13
C-CO2气体进行13C标记，标记期间，通过气体传感器观测植物生长室中的13C-CO2和O2浓度；通过温湿度计观测植物生长室中的温湿度变化，持续标记7d-10d后，用同位素质谱仪分析植物生长室、N标记室和具有标记的真菌室中基质的同位素13C丰度，以及植物体和具有标记的真菌的同位素13C丰度，每次完成标记后，使用广口瓶中碱性溶液充分吸收植物生长室中的13C-CO2气体，防止污染空气。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述高温连续灭菌的条件为121℃灭菌20min；所述基质由细砂和蛭石按照体积比1：1的比例组成。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述温室的条件为：白天/黑夜：25±2/18±2℃；光照12h，400±50μmolm-2.s-1；相对湿度：65±5％。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于：
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权 利 要 求 书
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所述步骤2)中，所述幼苗为核桃苗木，所述内生真菌为Phialocephala fortinii真菌，所述步骤3)中30-40天后检测苗木根系中是否具有携带标记的内生真菌；
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所述步骤4)中，所述N标记室NⅠ,NⅡ,NⅢ,NⅣ中的同位素15N由K15NO3提供，N的丰度为
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10.2％；所述N标记室NⅠ′,NⅡ′,NⅢ′,NⅣ′中的同位素15N由(15NH4)2S04提供，N的丰度为10.2％。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中，标记期间植物生长室中的13C-CO2的浓度维持在0.03％和O2浓度为21％；
若13C-CO2气体浓度低于0.03％，需要及时滴加盐酸溶液反应提高13C-CO2气体浓度；所述步骤5)中，标记期间植物生长室中的温度不超过30℃，湿度60％左右；当温度超过30℃时，使用控温组件调节温度至植物适宜的温度范围。
所述植物体包括植物根、茎和叶。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于：所述具有标记的内生真菌为具有荧光标记的内生真菌；
优选的，具有标记的内生真菌为具有荧光蛋白标记的内生真菌；
具有荧光蛋白标记的内生真菌为在内生真菌中导入编码标记蛋白基因从而表达标记蛋白的内生真菌；所述标记蛋白为可被观察或观测的蛋白。
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说 明 书
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一种同位素C-N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的方法和
装置
技术领域
[0001]本发明属于植物-微生物共生关系的科学研究技术领域，具体涉及一种研究内生真菌与宿主植物互惠共生的方法，同时涉及一种同位素标记内生真菌与宿主植物互惠共生的装置，该装置同样适用于同位素标记植物光合产物和根系吸收矿质元素的运输与分配。背景技术
[0002]矿质养分是植物生长发育的基础，然而，在传统农业中种植者过分追求产量，不合理的大量施用化学肥料改变了土壤微生物群落结构，破坏了自然环境中有益微生物群落对宿主植物的积极作用，限制了研究根系微生物群落与宿主植物的互惠共生关系。因此，设计同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的一体化装置对于开发利用植物有益微生物群落和农林业的健康栽培具有重要的生态学意义。[0003]CO2作为植物光合作用的主要原料，植物通过光合作用吸收CO2并将其同化为有机物运输至植物体各器官，为植物的生长发育提供能量。同时，根系微生物侵染宿主植物根系后，宿主植物为根系微生物的生长提供能量物质(如碳源)和繁衍场所，而有益根系微生物促进宿主植物吸收养分、水分及提高宿主植物的生物和非生物胁迫能力。当前的研究主要集中在使用同位素13C标记光合产物的分配及运输对植物生长发育的影响。[0004]随着同位素标记技术的成熟和发展，同位素标记装置以其效率高、成本低、易操控的优点应用于植物-微生物共生关系的研究中，而有益微生物群落和合成微生物群落以其生态环保、可持续的优点被大量应用于农林业健康的栽培模式中。因此，提高同位素13C-15N标记效率和准确性来揭示根系微生物与宿主植物的互惠共生关系，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
[0005]植物叶片光合产物的运输分配和根系养分吸收运输能力的强弱是相辅相成的，探究植物-微生物间的互惠共生关系时，在不同苗木中对植物光合产物或矿质元素的运输与分配单独进行同位素标记时，由于根系微生物对宿主的侵染差异会造成宿主长势不同，因此不同苗木间的差异会影响同位素标记结果的定量分析，并且不同苗木间的侵染具有工作量大、成本高等诸多缺点，为克服其缺点，提高效率，降低成本，实现快速揭示植物-微生物间的互惠共生关系，本发明提供了一种同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的方法，并且本发明中同位素13C-15N是对同一苗木进行标记，便于定量分析同位素标记结果，同时减少了不同苗木生长差异引起的共生差异，保证了结果的可靠性和准确性。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的一体化装置，该装置可对植物-微生物间的相互作用进行同时标记分析。装置小巧，结构简单，使用方便，自带光源，受天气环境的影响较小，并且装置中使用了不同孔径的尼龙网分隔根系和真菌菌丝，是研究内生真菌功能特性及其与宿主植物相互作用的便携式一
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体化装置。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：[0008]本发明的目的是这样实现的：
[0009]一种同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的装置，包括：[0010]箱体12，所述箱体12内部从左到右依次设置N标记室、中间部分、N标记室；所述中间部分从前到后依次设置具有标记的真菌室I 9、植物生长室(13C标记室)11、具有标记的真菌室II10；用于放置13C-15N同位素、具有标记的内生真菌、待标记植物和标记器材；[0011]隔离层，设于植物生长室11与N标记室和具有标记的真菌室I、II及N标记室与具有标记的真菌室I、II的接触面，用于分隔N标记室、具有标记的真菌室和植物生长室；[0012]所述隔离层包括：有机玻璃板、2mm尼龙网或20μm尼龙网；所述有机玻璃板设于所述箱体底部至高15cm以上的隔离层，所述2mm尼龙网和20μm尼龙网，设于所述箱体底部至高15cm以下的隔离层；
[0013]所述有机玻璃板还分别将两个N标记室各均匀分为4个N标记室，即NⅠ,NⅡ,NⅢ,NⅣ，NⅠ′,NⅡ′,NⅢ′,NⅣ′，用于分析内生真菌对宿主植物吸收不同15N形态的影响及宿主植物对不同15N形态的偏好，所有有机玻璃板交接处均使用防水胶密封；[0014]13C气体反应发生装置，设于所述植物生长室，用于生成13C-CO2气体进行13C标记，
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所述13C气体反应发生装置包括：带胶塞废液排放管15，用于排放反应废液；C-CO2反应杯16，设于植物生长室，用于盛放13C-Na2CO3溶液；带刻度三通阀滴定管20，设于反应杯16的上方，所述带刻度三通阀滴定管20中的三通阀设于箱体顶部，通过三通阀向所述反应杯16中注入HCl溶液与13C-Na2CO3溶液反应生成13C-CO2气体进行13C标记；[0015]气体传感器18，设于植物生长室，用于监测13C标记前后及标记过程中的CO2和O2浓度，CO2和O2气体作为植物光合作用的原料和产物，其浓度的变化可以实时表征苗木的生长状况，以初步判定同位素13C的标记效率；[0016]日光灯19，设于植物生长室，用长螺丝钉将其固定在箱体顶部，日光灯的电线从箱体顶端打孔出来，将接缝处使用防水胶密封，使其在光照不足或阴雨天补光，避免阴雨天对标记试验的影响；
[0017]带胶塞广口瓶组件，设于植物生长室，用于吸收13C标记前后的CO2气体；所述带胶塞广口瓶组件包括：[0018]挂钩22，设于植物生长室顶部，将橡皮塞固定在挂钩上可以上下移动打开或盖紧
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广口瓶，C标记前上提挂钩开启广口瓶充分吸收植物生长室中的CO2气体，标记开始后下移挂钩塞紧广口瓶，防止13C-CO2气体被碱性溶液吸收影响标记效率，标记结束后上提挂钩开启广口瓶充分吸收植物生长室中剩余的13C-CO2气体，防止CO2气体污染空气；[0019]带胶塞广口瓶，用于盛放碱性溶液充分吸收植物生长室中的CO2气体，以此提高标记效率和防止污染环境；[0020]温湿度计23，设于植物生长室，用于监测植物生长室中的温度和湿度，防止不适宜的温湿度影响植物的正常生长，由于温湿度是影响植物光合作用的重要环境因子，实时监测并调节植物生长室温湿度有利于提高植物的光合效率，以此提高同位素13C标记效率；[0021]温控组件，可以连通箱体内部，用于调节植物生长室中的温湿度；所述温控组件包括：冷却管24，设于植物生长室，用于调节植物生长室温湿度；冷水发生器26，设于箱体外
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侧，用于制冷控温水；气泵25，设于箱体外侧，用橡胶软管连接冷却管24和冷水发生器26，用于将冷水发生器中的控温水泵入冷却管。[0022]进一步的，所述箱体由有机玻璃制成，所述箱体顶部的有机玻璃板只密封所述植物生长室，所述N标记室、具有标记的真菌室I、具有标记的真菌室II敞口或透气不密封。[0023]所述植物生长室顶部右侧设置带把手箱门21，可随时打开和关闭箱门，箱门使用橡胶垫片密封，关闭时不会漏气。
[0024]所述2mm尼龙网分割的N标记室(NⅢ,NⅣ,NⅠ′,NⅡ′)、具有标记的真菌室Ⅱ可以通过真菌菌丝和植物细根，因此，2mm尼龙网分割的N标记室中的同位素15N可通过内生真菌和植物细根吸收；但是20μm尼龙网分割的N标记室(NⅠ,NⅡ,NⅢ′,NⅣ′)、具有标记的真菌室Ⅰ只能通过真菌菌丝，因此，20μm尼龙网分割的N标记室中的同位素15N只能通过内生真菌吸收。[0025]所述13C气体反应发生装置中，所述13C-CO2反应杯16放置在所述植物生长室11左侧，所述13C-CO2反应杯16的底部安装一根带胶塞废液排放管15，通过NⅢ穿过箱体壁至箱体外。
[0026]箱壁与所有导管穿过处均使用防水胶进行密封，以保证箱体严格密封。[0027]所述箱体的长×宽×高具体可为40×40×50cm；所述N标记室的尺寸为10×40cm，所述NⅠ、NⅡ、NⅢ、NⅣ，NⅠ′、NⅡ′、NⅢ′、NⅣ′标记室的尺寸均为10×10cm。所述具有标记的真菌室Ⅰ和具有标记的真菌室Ⅱ的尺寸均为20×10×50cm，植物生长室的尺寸为20×20×50cm。
[0028]本发明提供的利用上述装置研究同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的方法，包括下述步骤：[0029](1)基质准备：称取经高温连续灭菌3次的基质装入洁净的植物生长室、N标记室和具有标记的真菌室；每个室基质厚度均为20-25cm，基质厚度超出尼龙网隔离层高度5-10cm，使得上述各分隔室相对密封不透气；[0030](2)待标记幼苗移栽：选取苗龄20-30d的实生幼苗，截断主根后移栽至植物生长室中，每个植物生长室一棵幼苗，将所述装置放置于温室或自然环境中，移栽后在所述植物生长室、N标记室和具有标记的真菌室中浇灌无菌水，使基质含水量在60±5％，幼苗成活后每隔7d在N标记室浇灌1/2Long-Ashton medium营养液，在21d时将1/2Long-Ashton medium营养液替换为缺N的1/2Long-Ashton medium营养液，其它元素不变，浇灌时间仍为7d一次，营养液浇灌直到同位素标记试验结束；植物生长室和具有标记的真菌室不浇灌营养液，以促进根系或菌丝透过尼龙网吸收养分；[0031](3)建立共生体系：将具有标记的内生真菌等量(如：1×107cfu/ml，10ml)接种于20μm尼龙网和2mm尼龙网分隔的无菌的具有标记的内生真菌室I和具有标记的内生真菌室Ⅱ，若干天后检测苗木根系中是否具有携带标记的内生真菌，并观察标记的内生真菌在植物根系中的定殖部位及其侵染率，若成功定殖根系后，开始同位素13C-15N标记；[0032](4)同位素15N标记：在15N标记前，对待标记幼苗进行N饥饿处理1周，使用改良的缺N的1/2Long-Ashton medium营养液正常浇灌，一周后在箱体左侧的4个N标记室NⅠ,NⅡ,NⅢ,
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NⅣ中加入等量的同位素15N(K15NO3，N的丰度为10.2％)，在箱体右侧的4个氮标记室NⅠ′,
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NⅡ′,NⅢ′,NⅣ′中加入等量的同位素15N((15NH4)2S04，N的丰度为10.2％)开始标记，N标记室中的同位素15N浓度均为1mM，开始标记后正常浇灌缺N的1/2Long-Ashton medium营养液，其它元素不变，浇灌时间仍为7d一次，营养液浇灌直到同位素标记试验结束，持续标记7-10d后
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进行同位素15N丰度检测，取样时使用无菌水调节基质含水量在60±5％，N丰度采用同位素质谱仪进行测定，然后计算标记植株中的硝态氮(或铵态氮)的百分含量；计算公式为：[0033]硝态氮(或铵态氮)(％)＝[测定样品15N丰度(％)-自然界15N丰度(％)]/10.2％，自然界中15N丰度约为0.336％；其中，内生真菌帮助宿主吸收15NO3-的量为NⅠ和NⅡ标记室消耗的量，宿主根系吸收15NO3-的量为NⅢ和NⅣ标记室消耗的总量减去NⅠ和NⅡ标记室消耗的总量；内生真菌帮助宿主吸收15NH4的量为NⅢ′和NⅣ′标记室消耗的量，宿主根系吸收15NH4的量为NⅠ′和NⅡ′标记室消耗的总量减去NⅢ′和NⅣ′标记室消耗的总量；[0034](5)同位素13C标记：每天标记时间从上午09：00至下午17：00结束，标记前使用广口瓶中的碱性溶液充分吸收植物生长室中的CO2气体，并使待标记苗木碳饥饿处理一天，以此提高同位素13C标记效率；标记前，通过13C气体反应发生装置使13C-Na2CO3溶液与HCl溶液反应生成13C-CO2气体进行13C标记，标记期间，通过气体传感器观测植物生长室中的13C-CO2(0.03％)和O2(21％)浓度；通过温湿度计观测植物生长室中的温湿度变化，持续标记7-10d后，用同位素质谱仪分析植物生长室、N标记室和具有标记的真菌室中基质的同位素13C丰度，以及植物体(根、茎、叶)和具有标记的真菌的同位素13C丰度，每次完成标记后，使用广口瓶中碱性溶液充分吸收植物生长室中的13C-CO2气体，防止污染空气。[0035]上述方法步骤1)中，所述高温连续灭菌的条件为121℃灭菌20min。所述基质由细砂和蛭石按照体积比1：1的比例组成。[0036]上述方法步骤2)中，所述温室的条件为：白天/黑夜：25±2/18±2℃；光照12h，400±50μmolm-2.s-1；相对湿度：65±5％。[0037]上述方法步骤3)中，考虑到不同菌株对不同植物的侵染时间不一样，当幼苗为核桃苗木，内生真菌为Phialocephala fortinii真菌，所述步骤3)中于30-40天后检测苗木根系中是否具有携带标记的内生真菌。
15[0038]上述方法步骤4)中，所述N标记室NⅠ,NⅡ,NⅢ,NⅣ中的同位素15N由K15NO3提供，N的丰15
度为10.2％；所述N标记室NⅠ′,NⅡ′,NⅢ′,NⅣ′中的同位素15N由(15NH4)2S04提供，N的丰度为10.2％。
[0039]上述方法步骤5)中，标记期间植物生长室中的13C-CO2的浓度维持在0.03％和O2浓度为21％。若13C-CO2气体浓度低于0.03％，需要及时滴加HCl溶液或补充13C-Na2CO3溶液反应提高13C-CO2气体浓度。
[0040]上述方法步骤5)中，标记期间植物生长室中的温度不超过30℃，湿度60％左右；当温度超过30℃时，使用控温组件调节温度至植物适宜的温度范围。[0041]所述植物体包括植物根、茎和叶。
[0042]上述方法中具有标记的内生真菌可为具有荧光标记的内生真菌。[0043]具有标记的内生真菌可为具有荧光蛋白标记的内生真菌。
[0044]具有荧光蛋白标记的内生真菌可为在内生真菌中导入编码标记蛋白基因从而表达标记蛋白的内生真菌。所述标记蛋白为可被观察或观测的蛋白。[0045]示例性的，所述标记蛋白可为荧光蛋白，例如红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。示例性的，所述标记蛋白可为GFP蛋白。[0046]本发明中所述的Long-Ashton medium营养液的组成成分如下所示：[0047]2mM NH4NO3，0.6mM KH2PO4，0.042mM K2HPO4，1mM K2SO4，0.9mM CaCl2·2H2O，0.9mM
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MgSO4·7H2O，10.4uM MnSO4·4H2O，69uM H3BO3，1.2uM ZnSO4·7H2O，1.7uM CuSO4·5H2O，0.13uM NaMoO4·2H2O，0.05uM CoSO4·7H2O，10uM Fe-EDTA。本发明中使用的1/2Long-Ashton medium营养液是将上述各组分的浓度减半；本发明中使用的改良的缺N的1/2Long-Ashton medium营养液是将1/2Long-Ashton medium营养液去除NH4NO3组分，其它营养成分保持不变。
[0048]与现有技术相比，本发明具有以下优点：[0049](1)实现了内生真菌与宿主植物互惠共生关系研究的一体化标记装置：
[0050]传统方法对植物-微生物间的共生关系研究都采取在不同树体间进行单一同位素标记的途径，工作繁琐，成本高。本发明通过不同孔径的尼龙网将待标记苗木、内生真菌和待标记元素分隔形成一体化装置，在同一棵树体中进行多种同位素同时标记，快速揭示内生真菌与宿主植物间的相互作用，这对于土壤有益微生物群落和合成微生物群落的开发利用显得尤为重要。[0051](2)解决了定量分析内生真菌功能特性的问题：[0052]本发明采用2mm和20μm尼龙网将N标记室、GFP真菌室和植物生长室分隔，较传统回接侵染方法(根系与真菌菌丝处于同一环境)更便于研究内生真菌的功能特性及宿主植物对内生真菌生长的影响，通过分析2mm和20μm尼龙网分隔的N标记室的同位素15N浓度差异，从而可以定量揭示内生真菌对宿主吸收矿质元素的影响；[0053](3)大大提高了同位素13C-15N标记效率：[0054]本发明采用了一体化标记装置，较传统标记方法(不同树体间单一同位素标记)操作简单、快速，并且装置中的标记气体、元素和温湿度可控性强，这样在一体化装置中同时标记的方法必然大大提高了标记效率和标记准确度。
附图说明
[0055]图1为本发明一种同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生装置的示意图。
[0056]1—N标记室NⅠ、2—N标记室NⅡ、3—N标记室NⅢ、4—N标记室NⅣ、5—N标记室NⅠ′、6—N标记室NⅡ′、7—N标记室NⅢ′、8—N标记室NⅣ′、9—GFP真菌室Ⅰ、10—GFP真菌室Ⅱ、11—植物生长室、12—箱体、13—20μm尼龙网、14—2mm尼龙网、15—带胶塞废液排放管、16—反应杯、17—待标记植物、18—气体传感器、19—日光灯、20—带刻度三通阀滴定管、21—带把手箱门、22—挂钩、23—温湿度计、24—冷却管、25—气泵、26—冷水发生器、27—盛放碱性溶液的带塞广口瓶、28—K15NO3、29—(15NH4)2S04、30—植物细根、31—携带GFP标签真菌菌丝、32—植物生长室(13C标记室)。
具体实施方式
[0057]下面通过具体实施例和附图对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0058]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0059]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
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Phialocephala fortinii菌株是实验室从核桃根系中分离并长期保存的核桃根
系内生真菌资源。pCT74质粒中具有GFP基因和潮霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。pCT74质粒：武汉淼灵生物科技有限公司。[0061]在500ml三角瓶中加入200ml PDB培养液，接入5ml Phialocephala fortinii孢子液(2×105cfu/ml)，在28℃、200rpm条件下培养36h。经过无菌滤纸过滤并收集菌丝，用无菌的0.7M NaCl溶液冲洗3-4次，将其转移至无菌的50ml离心管，加入裂解酶溶液在28℃、200rpm条件下酶解2h。使用无菌滤纸在0.7M NaCl溶液中将酶解物滤除(5次/2min)，将收集的滤液在4℃和4000rpm条件下离心15min后弃上清，加入5ml STC溶液轻轻晃动后在4℃和4000rpm条件下离心15min，所得白色沉淀即为原生质体(1×106cfu/ml)。[0062]将上述制备的原生质体(5ml)与pCT74质粒(50μl)混合加入10ml离心管，轻轻晃动1-2次后冰浴15min，加入2ml PEG4000溶液(60％)，再轻轻晃动1-2次后冰浴15min，加入5ml PDB培养液后混匀，在28℃条件下培养12-24h，取100ml培养液涂布于含涂布于含8mg·L-1抗潮霉素(Hyg)的PDA平板上，28℃黑暗培养7-10d后获得转化子，将其接种到PDA培养基上培养3-5d，连续继代5次后使用LSM 510激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss，Oberkochen,Germany)检测转化菌株是否带有荧光标签。
[0063]图1示出了一种同位素13C-15N标记Phialocephala fortinii与宿主植物互惠共生装置的示意图。
[0064]如图1所示，本发明的一体化装置包括：箱体，由有机玻璃制成，包括N标记室、GFP真菌室和植物生长室(13C标记室)，用于放置待标记植物、带GFP标签的Phialocephala fortinii真菌、待标记同位素和标记器材；N标记室，用于放置待标记15N同位素和植物生长所需矿质养分；GFP真菌室，用于培养携带GFP标签的Phialocephala fortinii真菌；植物生长室，用于放置待标记植物、密封13C-CO2同位素标记气体及标记器材；2mm和20μm尼龙网，用
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于分隔N标记室、GFP真菌室和植物生长室，便于定量研究植物-微生物间的共生关系；C气体反应发生装置，用于释放13C-CO2同位素标记气体，其包括带胶塞废液排放管，用于排放反应废液；反应杯，设于植物生长室，用于盛放13C-Na2CO3溶液；带刻度三通阀滴定管，设于植物生长室，通过箱体顶部的三通阀注入HCl溶液与13C-Na2CO3溶液反应生成13C-CO2气体进行13C标记；带胶塞广口瓶，用于盛放碱性溶液(氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化钙等强碱性溶液，浓度为2mol/L)吸收标记前后和控制标记过程中的13C-CO2浓度；日光灯，用于补光；温湿度计，用于实时监测植物生长室中的温湿度变化；气体传感器，用于实时监测植物生长室中的CO2和O2浓度变化；温控组件，用于调节植物生长室温湿度。[0065]具体地，本发明的一体化装置如图1所示，箱体由有机玻璃制成，其长×宽×高为40×40×50cm，箱体严格密封不漏气，箱体由有机玻璃板、2mm和20μm尼龙网分隔形成8个N标记室，2个GFP真菌室，1个植物生长室。箱体顶部的有机玻璃板只密封植物生长室，N标记室和GFP真菌室敞口或透气不密封，便于浇水和施加营养液。箱体左侧的N标记室使用有机玻璃板分隔为NⅠ、NⅡ、NⅢ和NⅣ，箱体右侧的N标记室使用有机玻璃板分隔为NⅠ′、NⅡ′、NⅢ′和NⅣ′，均匀分隔的8个标记室大小为10×10×50cm(长×宽×高，下同)，NⅠ、NⅡ与GFP真菌室Ⅰ使用20μm尼龙网(0-15cm的高度)和有机玻璃板(15-50cm)分隔；NⅠ′、NⅡ′与GFP真菌室Ⅰ使用2mm尼龙网(0-15cm)和有机玻璃板(15-50cm)分隔；NⅢ、NⅣ与GFP真菌室Ⅱ使用2mm尼龙网(0-15cm)和有机玻璃板(15-50cm)分隔；NⅢ′、NⅣ′与GFP真菌室Ⅱ使用20μm尼龙网(0-15cm的高度)和有
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机玻璃板(15-50cm)分隔；GFP真菌室Ⅰ与植物生长室通过20μm尼龙网(0-15cm)和有机玻璃板(15-50cm)分隔；GFP真菌室Ⅱ与植物生长室通过2mm尼龙网(0-15cm)和有机玻璃板(15-50cm)分隔，GFP真菌室Ⅰ和Ⅱ的大小为20×10×50cm，植物生长室的大小为20×20×50cm。植物生长室顶部右侧设置带把手箱门21，可随时打开和关闭箱门，箱门使用橡胶垫片密封，关闭时不会漏气。将连续灭菌(121℃，15min)3次的湿润(饱和含水量的60±5％)无菌基质(细沙：蛭石＝1:1，v/v)装入N标记室、GFP真菌室和植物生长室，基质厚度为20-25cm(具体厚度视苗木大小而定)。在植物生长室11左侧放置13C-CO2反应杯16，反应杯16的底部安装一根带胶塞废液排放管15，通过NⅢ穿过箱壁至箱外，用于将反应废液排出，通过箱顶接入带刻度三通阀滴定管20，并设于反应杯16的上方；带刻度三通阀滴定管的顶部通过三通阀控制，三通阀与箱顶连接处使用防水胶密封。植物生长室右侧放置一个盛放碱性溶液的带塞广口
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瓶27，广口瓶胶塞使用挂钩连接箱顶，挂钩可以上下移动打开或盖紧广口瓶，C标记前上提挂钩开启广口瓶充分吸收植物生长室中的CO2气体，标记开始后下移挂钩塞紧广口瓶，防止13C-CO2气体被碱性溶液吸收影响标记效率，标记结束后上提挂钩开启广口瓶充分吸收植物生长室中剩余的13C-CO2气体，防止剩余13C-CO2气体污染环境。植物生长室悬挂气体传感器18和温湿度计23，在箱体顶部处用防水胶密封，用于实时检测植物生长室中的气体浓度(CO2和O2)和温湿度变化情况。植物生长室中接入60瓦的日光灯19，电源线穿过箱顶至箱外连接电源开关，用于补光，在阴雨天也能正常进行同位素标记试验。植物生长室右侧放置冷却管24，冷却管连接橡胶导管经NⅢ′透过右侧箱壁，与箱体外部的气泵25和冷水发生器26连接，用于调节植物生长室温湿度变化。箱壁与所有导管穿过处均使用防水胶进行密封，以保证箱体严格密封，提高同位素13C-CO2标记效率。
[0066]本发明所提供的同位素13C-15N标记内生真菌与宿主植物互惠共生的方法，包括下述步骤：[0067](1)按照上述所述内容将一体化装置安装完成，并将其置于温室或自然环境中。本实施例对核桃根系Phialocephala fortinii真菌与其宿主的共生关系进行同位素标记研究，也可用于其他经济林木或多年生木本植物的根系微生物与宿主的共生关系研究或矿质元素的运输与分配关系研究中。[0068]基质准备：称取经高温(121℃，20min)连续灭菌3次的基质(细砂：蛭石＝1：1，体积比)5-10kg装入洁净的植物生长室(长×宽×高＝20×20×50cm)、N标记室(长×宽×高＝10×40×50cm)和GFP真菌室(长×宽×高＝20×10×50cm)，基质厚度为20-25cm，基质厚度超过尼龙网隔离层5-10cm，使得上述3个分隔室相对密封不透气。
[0069]本研究将20-30d的核桃苗木截断主根(便于侧根/须根生长)后移栽至植物生长室，待移栽苗木成活后将携带GFP标签的Phialocephala fortinii真菌培养至GFP真菌室，将其置于温室(白天/黑夜：25±2/18±2℃；光照12h，400±50μmolm-2.s-1；相对湿度：65±5％)培养(植物生长室顶部的带把手箱门在同位素标记前敞开)，移栽后在所述植物生长室、N标记室和具有标记的真菌室中浇灌无菌水，使基质含水量在60±5％，幼苗成活后每隔7d在N标记室浇灌1/2Long-Ashton medium营养液，在21d时将1/2Long-Ashton medium营养液替换为缺N的1/2Long-Ashton medium营养液(N元素饥饿处理7d提高同位素15N标记效率)，其它元素不变，浇灌时间仍为7d一次，营养液浇灌直到同位素标记试验结束，30d后检测核桃苗木根系中是否具有携带GFP标签的Phialocephala fortinii真菌侵染，将成功侵
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染的苗木用于同位素标记试验，同时使用防水胶密闭装置顶部的有机玻璃盖。[0070]具体地，对同位素15N进行标记时，标记前，对核桃幼苗进行N饥饿处理1周，使用改良的缺N的1/2Long-Ashton medium营养液正常浇灌，一周后在箱体左侧的4个15N标记室
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(NⅠ,NⅡ,NⅢ,NⅣ)加入等量的同位素15N(K15NO3，N的丰度为10.2％)，箱体右侧的4个15N标记
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室(NⅠ′,NⅡ′,NⅢ′,NⅣ′)加入等量的同位素15N((15NH4)2S04，N的丰度为10.2％)开始标记，八个N标记室中的同位素15N浓度均为1mM，其中，20μm孔径的尼龙网分隔的NⅠ、NⅡ、NⅢ′和NⅣ′标记室只有真菌菌丝能够通过，2mm孔径的尼龙网分隔的NⅢ、NⅣ、NⅠ′和NⅡ′标记室可以通过植物细根和真菌菌丝，选择2mm的尼龙网是因为内生真菌主要侵染该孔径大小以下的根系(约1-2mm)。开始标记后对核桃幼苗正常浇灌缺N的1/2Long-Ashton medium营养液，其它元素不变，浇灌时间仍为7d一次，营养液浇灌直到同位素标记试验结束。持续标记7-10d后进行同
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位素15N丰度检测，N丰度采用同位素质谱仪进行测定，自然界中15N丰度约为0.336％，计算公式为：硝态氮(或铵态氮)(％)＝[测定样品15N丰度(％)-自然界15N丰度(％)]/10.2％。其中，内生真菌帮助宿主吸收15NO3-的量为NⅠ和NⅡ标记室消耗的量，宿主根系吸收15NO3-的量为
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NⅢ和NⅣ标记室消耗的总量减去NⅠ和NⅡ标记室消耗的总量，NH4+同理。[0071](2)通过气体反应发生装置使盐酸与13C-碳酸钠溶液反应释放13C-CO2气体，进行同位素13C标记，注入盐酸溶液过程中，为防止反应过激烈，慢慢滴加盐酸，直到13C-CO2气体浓度为0.03％停止注入，为便于观察反应杯中13C-碳酸钠溶液的消耗情况，加入盐酸前滴加2-3滴酚酞指示剂，当反应瓶中的溶液颜色变为无色，说明13C-碳酸钠溶液已耗尽，将其反应废液通过废液排放管15排空，再加反应液。标记过程中，通过温湿度计实时观察植物生长室中的温湿度，当温度超过30℃时，使用控温组件调节温度至植物适宜的温度范围；通过气体传感器18实时观察植物生长室中的13C-CO2和O2气体浓度，以此提高同位素13C标记效率。[0072]具体地，对同位素13C进行标记时，优选上午09：00至下午17：00进行标记，标记前使用广口瓶27中的碱性溶液充分吸收植物生长室中的CO2气体，然后对待标记核桃苗木进行碳饥饿处理，即通过盛放碱性溶液的广口瓶27(氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化钙等强碱性溶液，浓度为2mol/L)充分吸收植物生长室中的CO2气体，减少植物生长室中的CO2气体，使植物处于碳饥饿水平，同时降低了原有CO2气体对13C-CO2气体的影响，以此提高同位素13C标记效率。标记前，通过13C气体反应发生装置使13C-Na2CO3溶液与HCl溶液反应生成13C-CO2气体进行13C标记。标记期间，通过气体传感器观测植物生长室中的13C-CO2(0.03％)和O2(21％)浓度，若13C-CO2气体浓度低于0.03％，需要及时滴加盐酸溶液反应提高13C-CO2气体浓度，若O2浓度超过21％，说明植物光合作用能力较强；另外，核桃根系为温度敏感性植物，当土壤温度超过30℃植物根系生命活动过程停止，因此本发明装置安装了温湿度计23和控温组件(冷却管24、气泵25、冷水发生器26)，通过温湿度计观测植物生长室中的温湿度变化(标记期间温度不超过30℃，湿度60％左右)，若温度超过30℃，及时打开控温组件对植物生长室的温度进行调控，同时温控组件中的冷却管可以调节植物生长室中的湿度；持续标记7-10d后，用同位素质谱仪分析植物生长室、N标记室和GFP真菌室中基质的同位素13C丰度，以及植物体(根、茎、叶)和携带GFP标签的Phialocephala fortinii真菌的同位素13C丰度，结束标记后，使用广口瓶中的碱性溶液充分吸收植物生长室中的13C-CO2气体，防止剩余13C-CO2气体污染空气。
[0073]本研究选取的Phialocephala fortinii真菌侵染核桃根系的时间需要30d左右，
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同位素13C-15N标记持续7-10d后结束标记，对于其他植物需要根据目标真菌侵染宿主的时间，以及宿主吸收、运输和同化矿质元素的时间长短来确定标记时间。[0074]以上仅为本发明优选的实例而已，并不用于限制本发明，技术工作人员可根据实际需要对本发明进行更改。
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