蝴蝶兰不定芽的组培快繁技术

一４６一　江苏农业科学２０１３年第４１卷第５期　李正民，王安石，王．健，等．蝴蝶兰不定芽的组培快繁技术［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（５）－４６—４９　蝴蝶兰不定芽的组培快繁技术　李正民　，王安石　，王健　，陶　楚　（１．海南大学园艺园林学院，海南海口５７０２２８；２．海南出入境检验检疫局热带植物隔离检疫中心，海南海ＩＺｌ　５７０３１１）　摘要：通过诱导蝴蝶兰豹斑花花梗腋芽萌发出无菌不定芽，以不定芽为外植体，建立蝴蝶兰无菌培养体系。结果　表明：在花宝１号３．０　ｇ／Ｌ＋ＢＡ　３．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖２Ｏ　Ｌ的培养基中，腋芽萌发效果很好。采用　Ｌ　（４　）正交设计探讨基本培养基、ＢＡ、ＮＡＡ、蔗糖４个因素对蝴蝶兰不定芽增殖的影响，得出ＢＡ是影响增殖系数的主　要因子，ＮＡＡ、基本培养基次之，蔗糖最弱。ＭＳ＋ＢＡ　８．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．８　ｍｒ／Ｌ＋蔗糖２０　Ｌ对不定芽增殖有良好的效　果，增殖系数能够达到２．８３。诱导蝴蝶兰生根的最佳培养基为花宝１号３．５　Ｌ＋ＭＥＴ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５　ｍ异／Ｌ＋蔗　糖２０　ｇ／Ｌ。移栽基质以水苔最好，成活率达９３．１８％。　关键词：蝴蝶兰；不定芽；组织培养　中图分类号：Ｓ６８２．３１０．３６　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２０１３）０５—００４６—０４　蝴蝶兰（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ｓｐｐ．）别称蝶兰，属热带或亚热带的　气生兰，其株型美观，花形奇特，色彩艳丽，花期长久，在热带　兰中有“兰花皇后”之美誉，其盆栽和切花在国际花卉市场上　部位，在距腋芽上下两端约２　ａｍ处进行切段，接着剥去腋芽　外面的苞片，置于０．１％氯化汞溶液中消毒１２　ｍｉｎ，然后用无　菌水冲洗５遍，并按预设的试验方案接种到事先准备好的培　养基上。　１．３培养基的配置　有很高的经济价值ｕｊ。蝴蝶兰不能进行传统分株繁殖，自然　条件下种子也很难萌发，目前的繁殖方式有３种：一是近成熟　果实消毒后无菌播种产生实生苗，操作简单易行，但容易有花　色分离等变异情况发生　；二是利用茎尖、叶片等外植体诱　导类原球茎，经过分割增殖最终分化成苗，该方法取材广，类　原球茎可多次分割继代，繁殖系数高，但经过愈伤组织阶段有　试验涉及ＫＣ、ＶＷ、ＭＳ、１／２ＭＳ、花宝ｌ号（Ｎ—Ｐ—Ｋ：７—　６—１９，下略）５种基本培养基，在此基础上按不同的试验阶段　和目的添加不同浓度、不同配比的植物激素。调节所有培养　基的ｐＨ值为５．８，并用０．８５％卡拉胶固化，分装到聚丙烯组　较高变异率，所分化的试管苗也偏弱；三是丛生芽途径即利用　花梗腋芽直接诱导出不定芽并继代增殖　，该方法虽取材受　培袋中，在１２１℃条件下灭菌２４　ｍｉｎ，待冷却凝固后使用。　１．４试验设计　限，但可以根据蝴蝶兰花朵性状表现情况筛掉无商业价值和　携病毒株等不良植株，根据需求选择表现优秀的母本扩繁避　免不必要的浪费，且所诱导的不定芽均能高度保留母本优良　１．４．１不定芽的诱导选用５种基本培养基：ＫＣ、ＶＷ、ＭＳ、　１／２ＭＳ、花宝１号３．０　ｇ／Ｌ，培养基均附加ＢＡ　３．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．３　ｍｓ／Ｌ＋蔗糖加　Ｌ。每袋接种１个花梗腋芽，每种培养　基接种４０袋，重复３次。５０　ｄ后记录并统计各处理的生长　情况。　１．４．２不定芽的增殖花梗腋芽诱导出不定芽后，将所获得　性状，极少存在变异，满足蝴蝶兰规模化生产的要求　。本　试验旨在利用蝴蝶兰花梗腋芽为外植体，探索其不定芽快繁　体系，以期为蝴蝶兰组培苗的工厂化生产提供依据。　１材料与方法　的不定芽在无菌操作台上分切为单芽后转入准备好的增殖培　养基中进行增殖培养。增殖试验设基本培养基、ＢＡ、ＮＡＡ、蔗　１．１供试材料　糖４因素４水平的Ｌ１　（４　）正交试验（表１），共１６个处理，每　个处理２ｏ袋，每袋接种３个芽。６０　ｄ后统计各处理的增殖情　况，所得数据用ＳＡＳ软件分析。　表１　Ｌｌ６（４　）因素及水平表　供试蝴蝶兰材料为采自海南省文昌市动植物隔离检疫农　场蝴蝶兰品种圃的豹斑花（Ｄｔｐｓ．Ｌｅｏｐａｒｄ　Ｐｒｉｎｃｅ）优良植株。　１．２取样与消毒　选晴天１１：００左右取材，用无菌刀片切取健壮的蝴蝶兰　植株花苞初始开放的幼嫩花梗。参考潘学峰等的消毒方　法　］，首先用７５％乙醇对花梗进行全面喷淋后放置于无菌操　作台上，用浸在７５％乙醇中的湿棉球对花梗作进一步的表面　清洁与消毒，待花梗表面稍干后，选取花梗上带有饱满腋芽的　１．４．３生根培养增殖芽长成不具根的幼苗时需将幼苗分　开转入生根培养基中进行生根培养。本试验选择花宝１号　３．５　ｇ／Ｌ为基本生根培养基，附加０．５　ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ、２０　ｇ／Ｌ蔗　收稿日期：２０１２—１０—１Ｏ　基金项目：海南省三亚市院地合作项目（编号：２０１０ＹＤ５９）。　作者简介：李正民（１９８８一），男，山东泰安人，硕士研究生，主要研究　方向为热带花卉组培。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｚｈｅｎｇｍｉｎ１９８８＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｒｎ。　通信作者：王健，教授。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｊｙｙｍ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｌｎ．ａｎ。　糖，ｐＨ值５．８；设置多效唑（ＭＥＴ）０（ＣＫ）、０．２、０．４．０．６．０．８、　１．０　ｍｇ／Ｌ　６个梯度处理来研究多效唑浓度对组培苗生根的影　李正民等：蝴蝶兰不定芽的组培快繁技术　响。每处理接种３Ｏ袋，每袋转接２棵无根幼苗，所转接无根　幼苗需生长势一致。转接后，每隔５　ｄ观察１次，６０　ｄ后统计　分析各处理的生根情况。　１．５培养条件　培养温度（２５±２）℃，光照强度１　５００～２　０００　ｌｘ，连续光　照１２　ｈ／ｄ。　１．６炼苗与移栽　炼苗与移栽是组培快繁中关键的一步。将生长健壮、根　系发达的试管苗置于温棚内自然环境下炼苗７　ｄ，棚内采取遮　阴措施，温度保持在２５—３５℃，空气湿度保持在８０％以上。　炼苗结束后，洗净试管苗根部的培养基，将试管苗置于甲基托　图２腋芽萌发芽现象　达到２．０以上（包含２．０），８号增殖系数更是接近３．０，为最　布津８００倍液中浸泡５　ｍｉｎ，晾干，选择植株健壮、生长势一致　的试管苗移栽到预先高温消毒好的基质中。基质共设有６组　处理：Ａ，水苔；Ｂ，泥炭：珍珠岩＝１：１（体积比）；Ｃ，小块松树　皮；Ｄ，椰丝；Ｅ，椰糠；Ｆ，椰块。每组处理一穴盘共４Ｊ４株，重复　３次，随机区组排列，６０　ｄ后统计成活率、植株鲜重，并用ＴＹＳ　一３Ｎ植物营养测定仪每组随机测量１Ｏ株移栽苗的叶绿素含　量（ＳＰＡＤ值）和含氮量，所得数据用ＳＡＳ软件分析。移栽后　棚内温度控制在１８—２８℃之间，最低不低于１５℃，最高不超　过３２　ｏＣ；湿度控制在７０％～８０％之间；光照控制在１万ｋ左　右；定期通风；各处理统一水肥管理，浇水以见干见湿为宜，试　管苗定植长出新根后再浇叶面肥。　２结果与分析　２．１基本培养基对花梗诱导的效果　由图１可知，５种培养基均能诱导花梗腋芽萌发不定芽。　其中，不定芽诱导率最高的是ＭＳ，可达到８６．８７％，但褐化较　严重，诱导的不定芽以单芽为多。花宝１号３．０　ｇ／Ｌ不定芽　率仅次于ＭＳ，为８５％，所萌发的芽体双芽和三芽居多，褐化　程度最轻（图２），可能与其铁盐含量低有关。１／２ＭＳ不定芽　萌发率为８３．３３％，位居第三，萌发的不定芽多单芽和双芽，　但都偏瘦弱，有中等程度褐化。Ｖｗ的诱导率为７５％，萌发的　不定芽约有２／３为双芽。萌发效果最差的是ＫＣ培养基，不　定芽率最低且芽体瘦弱，可能与其营养元素不够丰富有关。　综合来看，蝴蝶兰花梗腋芽诱导适宜的培养基为花宝１号　３．０　ｇ／Ｌ＋ＢＡ　３．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖２０　ｇ／Ｌ。　１ｏｏ　９０　餐　酞　８０憨　７ｏ　６０矧　蟋　５０　４０　培养基　３・Ｏｇ／ｔ，　不定芽率＝萌发不定芽率腋芽数／接种数ｘ１００％　图１　不同培养基对花梗诱导的效果　２．２不定芽的增殖　在表２中可以看出，１６个处理中，除１号增殖系数为　０．８３外，其余１５个增殖系数均大于１；７、８、１２、１４号增殖系数　高。由极差Ｒ可看出，不定芽增殖的影响因素依次为Ｂ＞Ｃ＞　Ａ＞Ｄ，说明ＢＡ含量对蝴蝶兰不定芽增殖起主要作用，其次　是ＮＡＡ含量和基本培养基，蔗糖浓度的影响最小。从　值可　得出各因素在增殖阶段的较优水平，分别是ＭＳ、ＢＡ　８．０　ｍｇ／Ｌ、　ＮＡＡ０．８　ｍｇ／Ｌ、蔗糖２Ｏ　ｇ／Ｌ。用Ｄｕｎｃａｎ’ｓ法分析结果表明，Ａ：　与Ａ　差异显著，与　、Ａ　差异不显著；Ｂ　与Ｂ　Ｂ：、Ｂ３差异　显著；Ｃ，与Ｃ　差异显著，与Ｃ　、Ｃ　差异不显著；Ｄ因素各水　平之间无显著差异。综上所述，蝴蝶兰不定芽增殖阶段的适　宜处理组合是ＭＳ＋ＢＡ　８．０　ｒａｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．８　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖　２０　ｇ／Ｌ，增殖倍数达到２．８３倍（图３）。　表２不定芽增殖培养基优化正交试验设计与结果　注：增殖系数＝新增殖芽数／接种数；同列不同小写字母表示差　异显著（Ｐ＜Ｏ．Ｏ５），表４同。　２．３生根培养　所设６组处理，生根萌动时间大都集中在４０　ｄ后，并无　太大差异。由表３可以看出，多效唑有明显促进生根作用，其　浓度与生根率和根数呈正相关，与根长呈负相关。在对照组　里，生根率可以达到７８．３３％；在多效唑添加量达到０．８　ｍｒ／Ｌ　后，生根率达到１００％，除０．２　ｒｎｇ／Ｌ　ＭＥＴ处理外，其余处理均