河豚毒素的检验

论著摘要·　刑事技术２０００年第４期　河豚毒素的检验　公安部物证鉴定中心ｆ北京１０００３８）孙口一　一７，　（／　张继宗　ｆ　Ｔ）９，　ｙ）　静何毅　胡春华——一／　摘要通过对食用河豚鱼干致死案例的系统毒物分析，本文详钿介绍了有关体内河豚毒素的固相萃取方　法，利用本方法成功地解决了一起因河豚毒素中毒案件的检验，从死者胃内容、心血中均栓出河豚毒素，从死者吃　剩的干鱼片中检出１．４１￣ｇ／ｇ的河豚毒素。　／　、关键词　河豚鱼　河豚毒素　ＴＴｘ）　＾一固相苹取　　，　中为，　刁　丰壶５皇　河豚毒素（Ｔｅｔｒｏｄｔｏｘｉｎ，简写为ＴＴＸ）是河豚鱼中所　１．２　Ｃ　碱基液的制备　含的有毒物质，为氨基全氢喹唑啉化合物，分子式为　ｃ　．Ｈ－　ＯｅＮ　（分子量为３１９．３）。河豚鱼含河豚毒素最多　的部位是卵巢，其次是肝脏，肠、血、肾和皮。如果在食　用之前没有正确地除去这种毒素，则极易发生食后中　毒及死亡事件。　河豚毒素属剧毒物，是毒性最强的非蛋白类神经　毒素之一，ＴＴＸ对人的致死量为６￣ｇ／ｋｇ～７￣ｇ／ｋｇ｛“，　ＴＴＸ化学性质相当稳定，日晒、盐腌及～般烹调手段均　难以破坏，中毒后也缺乏有效的解救措施　故而食用盐　腌河豚、河豚鱼干均容易引起中毒，且死亡率高１　２ｌ　ＴＴＸ　的毒性作用主要是对随意机（包括呼吸肌）进行麻痹，　它能选择性地与神经和肌肉细胞膜表面的Ｎａ　的通道　上的蛋白质结合，阻断Ｎａ　影响神经肌肉间兴奋性的传　导，使神经肌肉呈麻痹状态。中毒症状主要表现为头晕　头疼、恶心呕吐腹泻、知觉麻痹、唇舌及肢端麻木、运动　障碍、血压下降、言语不清、呼吸困难，严重者可因呼吸　衰竭而死亡　。　河豚毒素精制品为白色无定形的粉末，微溶于　水，易溶于酸，几乎不溶于无水乙醇和其它有机溶剂，　中性或酸性条件下对热稳定，在碱性条件下易分解生　成２一氨基一８一羟基一６一羟甲基一喹唑啉，文献中　般称为ｃ，一碱基　ｌ。　ＴＴｘ的分析检测方法目前国内比较成熟的是用　“小白鼠”做动物实验和用“酶联免疫法”做筛选实验，　这两种实验的阳性结果，只能表明有“鱼毒”成份存在，　不能确认就是河豚毒素。此外，国外也曾报道过用液相　色谱和气相色谱等方法分析河豚毒素　、　国内陆惠民　也有过相关报道（中国刑警学院教材）。本文报道的是　用固相提取法结合衍生化手段进行检验河豚毒素。　ｌ　标样的制备及Ｃ　碱基的制备　１．１　ＴＴＸ标样的配制　称取２ｒａｇＴＴＸ用４ｍｌ　０．５％ＨＡＣ液溶解，制得　０．５ｍｇ／ａｌｌ的０　５％ＨＡＣ的ＴａＸ标准溶液。　取出１ｍｌ浓度为０．５　ｍｇ／ｍｌ的ＴＴＸ标液，加人１ｎｄ　１．５ｍｏｌ／Ｌ　ＫＯＨ，在一定温度ｌ８０℃～９ｏ屯）下加热　４５ｒａｉｎ，使ＴＴＸ碱化为Ｃ　碱基，反应完成后将Ｃ　碱液调　为ｐＨ４，并用水稀至５ｍｌ，制得含１ｒⅨ浓度为０．１ｍｇ／ｍ］　的Ｃ　碱基标准液（ｐＨ４）（称为ＴＴＸ—Ｃ　碱基液）。　订ｘ在碱性条件下转化为Ｔｒｘ—Ｃ　碱基　２液液提取方法　取１ｍｌ空白水液两份，在其中一份中添加２５ｉ￣ｇ的　ｒｘ—ｃ　碱基液，另一份作为空白水样，调ｐＨ４后，分　别用１ｍｌ×２正丁醇提取两遍，合并正丁醇液，在一定　温度的空气流（或氮气流下）吹干，然后加入１００１￣１衍生　化试剂（ＢＳＡ：吡啶１：１），６０℃下反应２０ｍｉｎ，进样１　，　供ＧＣ／ＭＳ分析。　３固相萃取方法　因用正丁醇提取，浓缩时间相当长，为此又通过实　验建立了固相萃取法。结果表明，对ｃ　碱基固相萃取法　远远优于液液提取法，其主要优点是：ｆ１）不需很长的　浓缩时问；（２）浓缩液很干净；（３）回收率约为液一液提　取方法的二倍。　具体过程如下：取１ｍ１空白水液二份，在其中一份　中添加２５　ｇ的ＴａＸ—Ｃ　碱基，另一份作为空白对照样　品，分别调ｐＨ４后，过已活化的ｃ．ｓ固相柱（活化过程是　依次用５ｍｌ甲醇和５ｍｌ水洗柱），控制流出液流速以滴　状流出，然后用５ｍｌ～１０ｍｌ水洗涤小柱并将柱中残留　水份抽干（可将固相柱放在离心机上离心数分钟），再　用３ｎｄ甲醇来洗脱，收集洗脱液在８０℃用Ｎ　气流下吹　干洗脱液，加人１００１￣１衍生化试剂（ＢＳＡ：吡啶１：１），　６０℃下反应２０ｒａｉｎ，进样１）ｘｌ，供ＧＣ／ＭＳ分析。　９　维普资讯 http://www.cqvip.com

４检液的制备　第一步：使１Ｔｒｘ原体转化为ＴＴＸ—Ｃ　碱基。　（１）取空白水样２Ｏｒａｌ，添加２５　ｇ的１Ｔｘ，加冰乙酸　２ｍｌ～３ｍｌ，调水样ｐＨ为２～３，加热４０ｍｉｎ后，挥至约　５ｍｌ，转至试管中，加人２ｍｌ１．５ＮＫＯＨ，在碱性条件下加　热４５ｍｉｎ，取下立即用冷水冷却后，再调ｐＨ４　（２）取死　者呕吐物水液２０ｍｌ，加冰乙酸２ｍｌ～３ｍｌ调为ｐＨ２～３，　以下操作同（１）。（３）取死者胃内容液２０ｎｄ，以下操作同　【１）。（４）取死者吃剩的干鱼片２Ｅ，用２０ｍ１０．５％ＨＡＣ液　ｌ　６　３７　拉　；　８５　…　ｌ　　。温程４０ｒａｉｎ，过滤后挥至约５ｍｌ，转至试管中，以下操作　ｆ　（１　Ｊ　＼　、　【一１纯品１ＴＸ—　碱基一Ｔ　ｓ　第二步：过固相柱富集净化　【一２于鱼片中提取的Ｔｒｘ—Ｃ　碱基一ＴＭＳ　图１＂ＦＩＸ—Ｇ碱基一ＴＭＳ保留时间的ＧＣ／ＮＰＤ色谱图　将上述制备ｐＨ４的各检液，分别用Ｃ．ａ固相柱富集　挣化，以下操作同（１），然后衍生化。　５　ＧＣ／ＮＰＤ、ＧＣ／ＭＳ分析条件　５．１　ＧＣ／ＮＰＤ条件　仪器：ＨＰ５８９０／ＮＰＤ　色谱柱：ＨＰ一１　（３０ｍ×０．３２ｒａｍ×０．２５１．ｔｍ）　进样口／检测器温：２８０℃　柱温：２００％（１ｍｉｎ）１Ｑ　Ｎ２：ｌｍｌ／ｒａｉｎ　２８０￣Ｃ（５ｒａｉｎ　Ｊ　分流比：ｌＯ：１　ＧＣ／ＮＰＤ色谱图见图１　５．２　ＧＣ／ＭＳ条件　仪器：岛津ＱＰ一５０００ＧＣ／ＭＳ／Ｅ１　色谱柱：ＨＰ一５ＭＳ（３０ｍ　ｘ０．３２ｒａｍ　ｘ０．２５　ｍ）　进样／接口温：２８０￣Ｃ　柱温：１６０℃（１ｍｉｎ）２Ｑ　坐ｉ　２８Ｏ℃（１３ｍｉｎ　Ｊ　２．１ｍｌ／ｍｉｎ　从死者吃剩的鱼片中检出ＴＴＸ—Ｃ　碱基的质谱　图见图２。　参考文就　１．乔红．河豚毒素研究概况．卫生毒理学杂志，１９９７，１１（１）：５０　图２干鱼片中提取的１ＴＫ—Ｃ，碱基一ＴＭＳ总离子漉图　和干鱼片中提取的＂ＦＩＸ—Ｃ，碱基一ＴＭＳ的质谱图　Ａｎ出　ＪＰⅡＪ．Ｌｅｇａｌ　Ｍｅｄ，１９７８，３２．９７—１１１　５．Ｆｕ眦０　Ｍ０打ｖａ．ｅｔｅ．Ｔｈｅ　ｕ　ｏｆ　ｍａｓｓ　ｆｒａｇｍｅｎｔｏｇｒａｐ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｅ－　ｔｌ０ｎ　ｏｆ　ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｏａｒ　ｆｌｕｉｄｓ　Ｊｐｎ　Ｊ．Ｌｅｇａｌ　Ｍｅｄ，１９９２，４６　２　陈龙，等．河豚中毒死亡的法医学鉴定．法医学杂志，１９９８，　ｆ３）：１５　ｆ２）：１１７—１２０　６．Ｊ　ｌｋｅｂｕｅｈｉ．ｅｌｅ．Ｔｈｉｎ—Ｌａｙｅｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　山ｆｌａｍｅｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｌ０ｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅｔｒｏｄｏｔｏｘ￣ｎ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕ－　ｉｄｓ　Ｊ．ｏｆ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ　．１９９８．４３２：４０１—４０６　３，杨平，等海洋生物毒素研究现状国外医学卫生学分册，　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｌ　ａ１９９５．２２（２）：１１２　４．Ｋａｚｕｙｕｋｉ　Ｓｕｅｎａｇｅ．Ｖｅｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ　鳊辑：周静　收稿日期：１９９９—１１—２９　ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ　ＯＦ　ＴＥＴＲＯＤＯＴＯＸＩＮ　ＢＹ　ＧＣ　ＡＮＤ　ＧＣ／ＭＳ　Ｓｕｎ　Ｊｉｎｇ，Ｈｅ　ｙｉ，Ｈｕ　Ｃｈｕｎｈｕａ，ｅｔ　ａ１．　１ｎｓｔｉｔＭ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　ｓｃｉｅｒ￣ｃｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆｐｕｂｔｉｃ　ｓｅｃｕｒｉｔｙ．Ｂ耐咄１０００３８　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉ　ｐ　ｐｅｒ　ｄｅｓｃｒｌｂｅｄ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈ。ｄ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｅｔｉ“ｇ　ｔｅｔｒｏｄ。ｌｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｔｏｍａｃｈ　ｃ。ｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｈｅａｒｔ　ｂｌｏｏｄ　ｓａｎｐｌｅｓ．ｗｅ　ｈａｖｃｓｏｌｖｅｄ　ａ　ｃａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｄｓｕｃｃｅｓｓ　ｆｕｌｌｙ－　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ，ｇｌｏｂｅ　ｉｓｆｈ，ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ