Mesothelin在胰腺癌组织的表达及其临床意义

朱庆云;屠振兴;李兆申;满晓华

【摘 要】目的研究胰腺癌组织mesothelin的表达及其与临床肿瘤指标的关系.方法 (1)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测5株胰腺癌细胞株mesothelin mRNA的表达;(2)收集54例手术切除的胰腺癌及42例相应癌旁胰腺组织石蜡标本,利用EnVision免疫组化法分别检测癌组织和癌旁胰腺组织Mesothelin的表达情况.结果 5株胰腺癌细胞株均有mesothelin mRNA表达;54例胰腺癌中mesothelin阳性表达41例(75.9%),2例癌旁胰腺组织中均无阳性表

达;mesothelin阳性率与肿瘤分化程度相关(P ＜ 0.005),与肿瘤大小、淋巴及远处转移无关(P ＞ 0.05).结论 Mesothelin在胰腺癌组织中有较高的阳性表达率,检测其表达有助于胰腺癌的诊断,并可作为判断胰腺癌恶性程度的重要指标. 【期刊名称】《中华胰腺病杂志》 【年(卷),期】2005(005)001 【总页数】4页(P17-20)

【关键词】胰腺肿瘤;Mesothelin;免疫组织化学 【作 者】朱庆云;屠振兴;李兆申;满晓华

【作者单位】200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科 【正文语种】中 文

【中图分类】R735.9

胰腺癌是较常见而恶性程度高的消化系肿瘤，近年来其发生率在国内外呈上升趋势。胰腺癌的预后较差，预后情况的改善有赖于早期诊断，而胰腺癌的早期诊断非常困难。寻找敏感性高、特异性强的肿瘤标记物是胰腺癌早期诊断中亟待解决的问题。 Mesothelin是近年来新发现的胰腺癌肿瘤标记物[1]，国外对mesothelin在胰腺癌的表达情况研究报道较少，国内尚未有相关文献报道。本文检测胰腺癌组织mesothelin的表达情况，并和癌旁组织的表达进行比较，探讨其与胰腺癌临床病理指标的关系，旨在为胰腺癌的临床诊断、治疗及预后提供依据。 材料与方法 一、材料

胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988、BxPC3、CfPAC1、AsPC-1为第二军医大学附属长海医院消化内科实验室保存。54例人胰腺癌标本均来自第二军医大学附属长海医院胰腺外科2001年4月至2003年10月手术切除的胰腺癌组织，其中男性38例，女性16例，男∶女 = 2.37∶1 。年龄： ≤ 40岁3例，41 ～ 60岁20例， ≥ 61岁31例，平均年龄61.8岁。肿瘤部位：胰头44例(81.5%)，胰体尾10例(18.5%)。肿瘤大小： ≤ 3 cm 29例， > 3 cm 25例。病理组织学分类：浸润性导管癌52例(96.3%)，黏液性囊腺癌2例(3.7%)。可利用的癌旁胰腺组织42例。所有病例均经手术及病理学确诊，均有完整的手术记录资料及临床资料。 二、Mesothelin mRNA检测

采用RT-PCR法检测胰腺癌细胞株中mesothelin mRNA的表达。取冻存的胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988、BxPC3、CfPAC1、AsPC-1进行复苏，常规培养，待细胞铺满瓶底，用PBS冲洗3次，0.25%的胰酶消化，收集细胞记数、调整细胞数为1.5 × 107，1 000 rpm离心10 min，弃上清，用0.3 mol/L等渗蔗

糖溶液将细胞洗3次，1 000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀保存于-80℃备用。胰腺癌细胞株总RNA的抽提，按Trizol液的说明书进行。RT-PCR反应应用宝生物工程(大连)有限公司的一步反应法RT-PCR试剂盒进行。参照文献报道，mesothelin上游引物5′-AACGGCTACCTGGTCC-TAG-3′，下游引物5′-TTTACTGAGCGCGAGTT-CTC-3′，mesothelin基因的扩增片断为226 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。RT-PCR按试剂盒使用说明书进行。在50 μl反应体系中含5 μl 10x One Step RNA PCR缓冲液、10 μl MgCl2 (25 mmol/L)，5 μl dNTP mixture(10 mmol/L)，1 μl RNase Inhibitor(40 U/μl)，1 μl AMV RTase XT(5 U/μl)，1 μl AMV-Optimized Taq(5 U/μl)，1 μl上游引物(20 μmol/L)，1 μl下游引物(20 μmol/L)，1 μl总RNA，24 μl RNase灭活的双蒸水，于PCR扩增仪(Perkin-Elmer公司)扩增。RT-PCR反应体系条件为50℃逆转录45 min；95℃灭活及预变性3 min；再经95℃15 s，59℃ 15 s，72℃ 20 s，反应30个循环；72℃延伸4 min。取5 μl PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，通过UV凝胶成像扫描仪观察。 三、Mesothelin蛋白表达

应用免疫组化方法检测mesothelin蛋白表达。所有的标本用福尔马林固定，石蜡包埋。每份标本切成4μm的薄片，常规技术脱蜡至水，分别进行免疫组化染色(IHC)和HE染色。将切片插入塑料片架，放置在PBS缓冲液(0.01 mmol/L pH7.0)中，微波96℃，20 min，取出自然冷却至室温。然后水洗，PBS浸泡5 min，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶15 min，水洗，再次PBS浸泡5 min。1∶40稀释鼠抗mesothelin单克隆抗体(Close MESO1；NeoMarkers，Inc，USA)孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min。EnVision复合物孵育30 min，再次PBS洗3次，每次3 min，然后DAB显色，水洗，复染，封固，镜检。阴性对照采用PBS替代第一抗体。mesothelin定位于细胞膜上，阳性染色为棕黄色或棕

褐色。光镜下随机记数5个视野内细胞，计算染色细胞所占的百分数。染色细胞 ≥ 20%为阳性，染色细胞 < 20%为阴性。染色强度分为 + (淡黄色)，2 + (黄色)，3 + (棕黄色)，4 + (褐色)四个等级。 四、统计学处理

应用SPSS10.0统计软件进行χ2检验。 结 果

一、胰腺癌细胞株mesothelin mRNA的表达

4株胰腺癌细胞株抽总RNA后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现5S、18S、28S三条带，总RNA抽提成功。经RT-PCR检测，细胞株SW1990、PaTu8988、BxPC3、CfPAC1、AsPC-1均有mesothelin mRNA表达(图1)。

1-5：胰腺癌细胞株SW1990、PaTu8988、BxPC3、CfPAC1、AsPC-1，6：分子量标志图1 胰腺癌细胞株中mesothelin mRNA的表达 二、胰腺癌组织Mesothelin蛋白表达

Mesothelin免疫组化染色结果显示54例胰腺癌组织中，mesothelin阳性表达41例(75.9%)，阴性13例(24.1%)(图2)。在阳性的41例中，染色强度3 + 以上38例(92.7%)。42例可利用的癌旁胰腺组织中，mesothelin染色反应全部阴性(100%)，其中3例呈微弱的染色反应(染色细胞数10%左右)。在镜检中还发现大多数胰腺导管腺癌腺腔的腔缘有较强的染色反应，一部分癌组织及少数癌旁组织的小血管腔内缘也有染色反应，少数萎缩的胰管有微弱的染色反应。 三、Mesothelin表达与胰腺癌临床病理指标的关系

本组结果显示，mesothelin表达的阳性率在高分化胰腺癌组是58.4%，在中至低分化胰腺癌组是96.4%。两者相差非常显著(P < 0.005)，但mesothelin表达与肿瘤大小、淋巴转移、远处转移无关(表1)。 讨 论

胰腺癌发病率近年呈上升趋势，因其临床症状无特征性，同时缺乏敏感性高的早期诊断方法，故患者就诊时多属中晚期，许多患者失去了手术治疗的机会，预后极差。对其早期诊断成为亟待解决的问题，也引起越来越多的关注，胰腺癌肿瘤标记物的研究是胰腺癌早期诊断的重要内容之一，目前迫切需要敏感性高、特异性强的肿瘤标记物。

表1 Mesothelin与胰腺癌临床病理指标的关系临床指标例数Mesothelin蛋白阳性表达数(%)P值肿瘤直径(cm) ≤32920(70．0%)>0．05 >32521(84．0%)分化程度 高分化2614(53．8)<0．005 中低分化2827(96．4)淋巴转移 无2218(81．8)>0．25 有3223(71．9)远处转移 无4836(75．0%) 有65(83．3%)>0．05

A：中分化胰头癌(IHC × 200) B：中至低分化胰头癌(IHC × 200)；C：中分化胰体癌(IHC × 200) D：癌旁胰腺组织(IHC × 100)图2 Mesothelin在胰腺癌组织和癌旁组织的表达

Mesothelin是一种分子质量为4000的糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇锚于细胞膜，其功能尚不清，推测可能与细胞间的黏附和细胞间的相互作用有关[2]。Bera等研究报道在mesothelin基因剔除的突变鼠，其生长发育和繁殖均正常，证明mesothelin基因并不是鼠生长发育以及繁殖所必须[3]。在正常组织mesothelin主要表达在间皮细胞，也有报道在输卵管、肾、扁桃体、气管上皮有mesothelin蛋白表达[4]。在肺癌、食道癌、子宫颈癌、恶性间皮瘤和卵巢癌mesothelin蛋白呈高表达[5,6]。既往mesothelin作为肿瘤标记物主要用于恶性间皮瘤的诊断，2001年发现胰腺癌组织也有表达[1]，而正常胰腺组织并不表达[7,8]。国内外关于mesothelin作为胰腺癌肿瘤标记物的研究较少，而mesothelin作为一个胰腺癌新的肿瘤标记物以及可能的治疗和诊断位点引起了重视。本研究中5株胰腺癌细胞株均有mesothelin基因表达，并通过大样本量的检测发现：mesothelin在胰

腺癌组织的阳性率为75.9%(41/54)，尤其是在中分化腺癌中的表达率高达96.4%，而在癌旁胰腺组织基本不表达或者呈微弱的染色反应，按染色结果判断标准其阳性率0%。Argani等[1]报道mesothelin诊断胰腺癌的敏感性83%，特异性87%。与之相比较，本结果的敏感性略低，但特异性较高，达100%。因此mesothelin作为胰腺癌的肿瘤标记物可能有临床诊断和治疗价值。因为mesothelin在正常胰腺组织不表达或者微弱表达，局限性表达在中低分化胰腺导管癌，如在

mesothelin抗体上连结放射性物质，通过抗体的导向作用聚集在癌组织，可用于胰腺癌的早期诊断；或在mesothelin抗体上连接抗癌药物用于胰腺癌的治疗。本研究还发现大多数胰腺癌腺体腔内缘mesothelin染色强烈，另外在癌组织以及癌旁组织的小血管腔也有一定程度的染色。据此推测mesothelin可能会释放到胰液或者血液中。可以设想在血液、胰液、十二指肠液或者大便中检测mesothelin蛋白，对胰腺癌进行诊断。

我们的研究结果还显示，在高分化的胰腺癌组织中mesothelin表达阳性率为58.35%，而在中至低分化的胰腺癌组织中阳性率为96.43%，两者之间的比较有显著性差异(P < 0.005)，说明mesothelin表达的阳性率与肿瘤的恶性程度有关。研究结果表明mesothelin的表达与肿瘤大小、淋巴转移及远处转移无相关性。mesothelin功能目前不清楚，有学者推测与细胞间的黏附有关。如果

mesothelin的表达降低肿瘤细胞之间的黏附力，那么将有助于肿瘤的侵袭和转移。本研究结果尚不支持这一假设。mesothelin的表达与肿瘤生物学行为的关系以及mesothelin的作用机制有待进一步研究。 参 考 文 献

【相关文献】

1 Argani P, Iacobuzio-Donahue C, Ryu B, et al. Mesothelin is overexpressed in the vast majority of ductal adenocarcinomas of the pancreas: identification of a new pancreatic cancer marker by serial analysis of gene expression (SAGE). Clin Cancer Res, 2001,7:3862-3868.

2 Chang K, Pastan I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93: 136-140.

3 Bera TK, Pastan I. Mesothelin is not required for normal mouse development or reproduction. Mol Cell Biol, 2000,20:2902-2906.

4 Chang K, Pastan I, Willingham MC. Isolation and characterization of a monoclonal antibody, K1, reactive with ovarian cancers and normal mesothelium. Int J Cancer, 1992, 50:373-381.

5 Chowdhury PS, Viner JL, Beers R, et al. Isolation of a high-affinity stable single-chain Fv specific for mesothelin from DNA-immunized mice by phage display and construction of a recombinant immunotoxin with anti-tumor activity. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:669-674.

6 Hassan R, Viner JL, Wang QC, et al. Anti-tumor activity of K1-LysPE38QQR, an

immunotoxin targeting mesothelin, a cell-surface antigen overexpressed in ovarian cancer and malignant mesothelioma. J Immunother, 2000, 23:473-479.

7 Kojima T, Oh-eda M, Hattori K, et al. Molecular cloning and expression of megakaryocyte potentiating factor cDNA. J Biol Chem, 1995, 270:21984-21990. 8 Scholler N, Fu N, Yang Y, et al. Soluble member(s) of the mesothelin/megakaryocyte potentiating factor family are detectable in sera from patients with ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96:11531-11536.