miR-411-3p 靶向PAK2 介导Wnt 信号通路对口腔鳞状细胞癌侵袭和转移的影响及调控机制

doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2020.17.013

miR鄄411鄄3p靶向PAK2介导Wnt信号通路对口腔鳞状细胞癌侵袭和转移的影响及调控机制淤

麦明思摇赵摇焱于摇马摇锴摇(三亚市人民医院口腔科,三亚572000)

摇摇中图分类号摇R739郾8摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2020)17鄄2109鄄06

[摘摇要]摇目的:探究miR鄄411鄄3p靶向p21活化激酶2(PAK2)基因介导Wnt信号通路对口腔鳞状细胞癌侵袭和转移的影响。方法:收集我院52例口腔癌组织及正常口腔黏膜上皮组织。免疫组化检测组织中PAK2阳性表达,qRT鄄PCR及Westernblot检测miR鄄411鄄3p及PAK2表达。筛选PAK2高表达细胞系并将其分为:阴性对照组、miR鄄411鄄3pagomir组、miR鄄检测各组细胞miR鄄411鄄3p、Wnt1、GSK3茁、茁鄄catenin、E鄄cadherin、N鄄cadherin表达,CCK8检测细胞活力,划痕实验、Transwell检测细胞迁移和侵袭。AnnexinV鄄FITC/PI双染检测细胞凋亡情况。结果:与正常口腔黏膜上皮组织相比,癌组织中miR鄄411鄄3p表达下降,PAK2表达升高。与阴性对照组相比,miR鄄411鄄3p过表达或沉默PAK2能够抑制Wnt信号通路相关因子(Wnt1,茁鄄catenin)及N鄄cadherin表达,促进GSK3茁及E鄄cadherin表达,且联合组效果最为明显(P<0郾05),抑制口腔鳞癌细胞活力,减少信号通路进而抑制口腔鳞状细胞癌迁移、侵袭,促进癌细胞凋亡,有望成为口腔鳞状细胞癌治疗的重要靶点。

[关键词]摇miR鄄411鄄3p;p21活化激酶2;Wnt信号通路;口腔鳞状细胞癌;迁移;侵袭

癌细胞迁移和侵袭,促进其凋亡,且联合组效果更明显(P<0郾05)。结论:miR鄄411鄄3p可靶向抑制PAK2基因的表达介导Wnt

411鄄3pantagomir组、PAK2基因沉默组、联合组(miR鄄411鄄3pagomir联合PAK2沉默联合处理细胞)。qRT鄄PCR和Westernblot

EffectsandmechanismofmiR鄄411鄄3poncellinvasionandmetastasisinoralsquamouscellcarcinomatargetingPAK2viaWntsignalingpathway

MAIMing鄄Si,ZHAOYan,MAKai郾DepartmentofStomatology,SanyaPeople忆sHospital,Sanya572000,China

targetingp21activatedkinase2(PAK2)viaWntsignalingpathway郾Methods:OralsquamouscellcarcinomatissuesandnormaloralexpressionofPAK2,qRT鄄PCRandWesternblotwereutilizedtodetermineexpressionsofmiR鄄411鄄3pandPAK2intissues郾OralmiR鄄411鄄3pantagomirgroup,PAK2shRNAgroupandcombinedtreatmentgroup(cellstreatedwithmiR鄄411鄄3pagomirandPAK2si鄄

[Abstract]摇Objective:ToexploreeffectofmiR鄄411鄄3poncellinvasionandmetastasisinoralsquamouscellcarcinomaby

mucosalepithelialtissue,werecollectedfrom52patientsinourhospital郾ImmunohistochemistrywasadoptedtodetectpositivesquamouscellcarcinomacelllinewithhighestexpressionofPAK2wasdividedintoNegativecontrolgroup,miR鄄411鄄3pagomirgroup,lencing).qRT鄄PCRandWesternblotwereusedtodetectexpressionsofmiR鄄411鄄3p,Wnt1,GSK3茁,茁鄄catenin,E鄄cadherinandN鄄cadherinineachgroup郾CCK8wasusedtodetectcellviability郾WoundinghealingassayandTranswellassaywereadoptedtodeterminemigrationandinvasion郾AnnexinV鄄FITC/PIdoublestainingwasusedtodetectcellapoptosis郾Results:Comparedwithnormaloralfactors(Wnt1,茁鄄catenin)andN鄄cadherin,induceexpressionsofGSK3茁andE鄄cadherin,combinedtreatmentgroupshowedmostobviouschange(P<0郾05),andinhibitedcellviabilityoforalsquamouscellcarcinomacells,downregulatedmigrationandinvasionofcouldinhibitmigrationandinvasionoforalsquamouscellcarcinomacells,inducecellapoptosisthroughtargetingPAK2viaWntsignalingpathway,whohaspotentialtobecomeanimportanttherapeutictargetinoralsquamouscellcarcinoma郾

[Keywords]摇miR鄄411鄄3p;p21activatedkinase2;Wntsignalingpathway;Oralsquamouscellcarcinoma;Migration;Invasionmucosalepithelialtissue,expressionofmiR鄄411鄄3pwasdecreasedwhilePAK2expressionwasincreasedincancertissue郾ComparedwithNegativecontrolgroup,miR鄄411鄄3poverexpressionorPAK2silencingcouldinhibitexpressionsofWntsignalingpathwayrelatedcancercells,inducedapoptosiswhilecombinedtreatmentgroupshowedmoreprofoundchange(P<0郾05)郾Conclusion:miR鄄411鄄3p

摇摇口腔鳞状细胞癌指发病于口腔,以鳞状细胞为

淤本文受海南省自然科学基金(814390)资助。于通讯作者,E鄄mail:zhaoyan840116@163.com。

研究。

主的恶性肿瘤,是头颈部肿瘤中恶性程度最高且危害最大的肿瘤[1,2]。肿瘤的侵袭和转移是引起患者病情恶化的重要因素,因此寻找抑制肿瘤侵袭转移的方法十分重要[3]。p21活化激酶2(p21activatedkinase2,PAK2)属于进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋

作者简介:麦明思,男,主治医师,主要从事口腔疾病诊疗方面的

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白激酶,是小G蛋白Rho家族中GTP的重要效应物[4]。研究表明PAK2活性升高与人类肿瘤发生发展相关,如PAK2/PIX通路活化能诱导乳腺癌雌激素抵抗[5]。PAK2活化与晚期胃癌的进展及预后不良相关[6]。口腔鳞状细胞癌相关研究发现,相比于正常口腔黏膜组织,PAK2在口腔鳞癌中表达显著增强[7]。miR鄄411经研究证实在肾细胞癌、乳腺癌、大肠癌等多种肿瘤中均发挥抑癌因子作用[8鄄10]。但其在口腔鳞癌中的作用尚未阐明。Wnt通路经研究证实在包括口腔癌在内的头颈部肿瘤中均存在异常活化现象。本研究旨在探讨miR鄄411鄄3p靶向PAK2在口腔鳞状细胞癌中的作用及机制。

自来水冲洗。梯度酒精脱水,中性树胶封固。倒置显微镜观察组织染色情况。ImageJ软件统计癌组1郾2郾2摇PAK2沉默重组质粒构建摇UCSC获取人PAK2编码区序列(NM_002577),BLOCK鄄iTTMRNAiCACCGTCTGATAACGGAGAACTGGACGAATCCAGTT鄄Designer网站在线设计PAK2的shRNA序列(5忆鄄CTCCGTTATCAGAC鄄3忆)。在shRNA序列两端加上EcoR玉和BamH玉酶切位点。T4DNA连接酶将酶切后的pcDNA3郾1(+)质粒线性化载体与目的基因片段连接并过夜,转化至DH5琢大肠杆菌克隆。酶切电泳1郾2郾3摇细胞分组及转染摇人舌鳞癌细胞株HSC鄄4、Tca8113、TcaSll3及人颊鳞癌细胞株BcaCD885培养于含10%FBS及1%P/S的MEM培养基中,Westernblot筛选PAK2蛋白表达最高的细胞系用于后续实验并分为:阴性对照组(转染含有无关序列的重组质粒)、miR鄄411鄄3pagomir组(转染miR鄄411鄄3pagomir)、miR鄄411鄄3pantagomir组(转染miR鄄411鄄3p重组质粒)及联合组(miR鄄411鄄3pagomir联合PAK2沉默处理细胞)。

90%融合度进行转染,Opti鄄MEM培养基调整细胞密MEM分别与1郾5滋lLipofectamine3000及1滋gPAK2shRNA重组质粒(浓度为2滋g/滋l)混匀,以复合物加至含有口腔鳞癌细胞的24孔板,轻柔摇晃,培养24~48h后更换培养基。miR鄄411agomir、1郾2郾4摇qRT鄄PCR检测摇按Trizol试剂说明书提取口腔鳞癌细胞系总RNA。DEPC处理的超纯水溶解RNA,TransScript域GreenOne鄄StepqRT鄄PCRSuperMix试剂盒一步完成RT鄄PCR合成及PCR。反应体系和反应条件均依据试剂盒说明书操作。实时荧光定量PCR仪进行扩增,miR鄄411鄄3p以U6为内参,其2-驻驻Ct法计算相对表达量。

他检测因子以GAPDH为内参,引物序列见表1。miR鄄411antagomir及阴性对照的转染方式同上。

传代后取对数期细胞,待细胞生长至70%~antagomir)、基因沉默组(转染含有PAK2shRNA的鉴定后提取大肠杆菌中重组载体,-80益保存备用。织及正常黏膜组织的PAK2阳性表达率。

1摇材料与方法

1郾1摇材料

1郾1郾1摇试剂与仪器摇基因组DNA提取试剂盒、Li鄄域GreenOne鄄StepqRT鄄PCRSuperMix试剂盒、CCK8

pofectamine3000试剂盒、Trizol试剂盒、TransScript试剂盒购自赛默飞世尔;人舌鳞癌细胞株HSC鄄4、Tca8113、TcaSll3及人颊鳞癌细胞株BcaCD885购自拜力生物;miR鄄411鄄3pagomir、miR鄄411鄄3pantagomir购自上海吉玛制药技术有限公司;DAB染液、苏木素染液、伊红染液购自北京索莱宝;所有抗体购自ABCAM;Transwell小室购自北京明阳科华生物科技有限公司;Anexin鄄V鄄FITC染液、PI染液购自上海碧云天;流式细胞仪购自德国贝克曼;倒置显微镜购自奥林巴斯;实时荧光定量PCR仪购自赛默飞世尔;PCR引物序列由华大基因合成。

度至3伊105个/ml并接种于24孔板。将50滋lOpti鄄

1郾1郾2摇组织来源摇收集我院2017年5月至2018年10月通过外科手术切除的口腔鳞癌组织52例,术前均未进行放化疗及免疫治疗,其中男性38例,女性14例,年龄22~72岁,平均年龄(42郾2依7郾3)岁。其中高分化鳞癌28例,中分化鳞癌13例,低分化鳞癌11例。淋巴结转移36例,无淋巴结转移16例。以52例正常的口腔黏膜上皮组织作为对照,其中男性31例,女性21例,年龄24~68岁,平均年龄(40郾3依6郾9)岁。本研究经我院伦理委员会审批且1郾2摇方法

所有患者知情同意。

1郾2郾1摇免疫组化检测摇将癌组织及正常黏膜上皮组织以石蜡包埋后切片。60益温箱烤干,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,双氧水和蒸馏水洗涤,微波抗原修复。切片冷却后PBS冲洗,5%BSA室温封闭,加入一抗兔抗小鼠PAK2孵育1h,加入二抗山羊抗兔IgG孵育20min,PBS冲洗,DAB显色,苏木素复染,

1颐1充分混匀并于室温孵育5min。将DNA鄄脂质体

1郾2郾5摇Westernblot检测蛋白表达摇弃细胞培养液,PBS洗涤,RIPA裂解液裂解细胞,匀浆,离心后去上清,去离子水调整蛋白浓度,行SDS鄄PAGE凝胶电泳并将细胞转至PVDF膜。加入含5%BSA的GSK3茁、茁鄄catenin、E鄄cadherin、N鄄cadherin抗体,4益TBST,室温封闭1h。加入一抗兔抗鼠Wnt1、

Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.麦明思等摇miR鄄411鄄3p靶向PAK2介导Wnt信号通路对口腔鳞状细胞癌侵袭和转移的影响及调控机制摇第17期·2111·

过夜。加入二抗山羊抗兔IgG,4益孵育,取化学发光试剂A液与B液按1颐1混匀后,均匀滴加至NC膜,显影液显影。分析条带光密度,蛋白质相对表达1郾2郾6摇CCK8测定细胞活力摇将细胞悬液(约1伊105个)加入96孔板,设置阴性对照,37益、5%CO2度(450nm)。

培养过夜。加入CCK8溶液,检测0、24、48h吸光1郾2郾7摇细胞划痕实验摇实验前用marker笔对12孔板做背面标记,0郾25%胰酶消化细胞,将细胞接种于12孔板。待细胞铺满板底后,1ml枪头垂直于孔板划痕。去除细胞培养液,PBS冲洗,加入无血清迁移率。

MEM培养基,放入培养箱,48h后拍照并统计细胞1郾2郾8摇Transwell细胞侵袭实验摇按1颐10比例采用MEM培养基稀释Matrigel胶,后将100滋lMatrigel胶加入上室。DMEM培养基重悬细胞,调整至3伊量为目标条带与内参条带的灰度值比值。

1郾3摇统计学分析摇SPSS21郾0软件统计数据,计量资料以x依s表示;两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0郾05表示差异有统计学意义。

2摇结果

2郾1摇miR鄄411鄄3p与PAK2存在靶向结合关系摇与NC组相比,PAK2野生型3忆UTR荧光素酶活性被miR鄄411鄄3p显著抑制,而突变型3忆UTR荧光素酶活性未被抑制。说明miR鄄411鄄3p可靶向抑制PAK22郾2摇正常组织口腔鳞癌组织中miR鄄411鄄3p、PAK22)。与癌旁组织[(15郾34依1郾71)%]相比,癌组织中PAK2细胞阳性率[(73郾12依6郾29)%]上调。与正常口腔黏膜上皮组织相比,癌组织miR鄄411鄄3p表达显著下降,PAK2表达显著上升(P<0郾05)。表达摇PAK2蛋白在胞浆和核内表达存在差异(图基因表达(图1)。

600滋l含10%血清的DMEM培养基,依据Transwell3个视野对跨膜细胞进行计数,计算侵袭细胞数目。

105个/ml,取100滋l细胞加入上室,下室加入说明书进行结晶紫染色。染色结束后于光镜下选取

1郾2郾9摇AnnexinV鄄FITC/PI双染检测口腔鳞癌细胞凋亡取转染后细胞,PBS冲洗,离心后弃上清,调整细胞浓度为4伊105个/ml,加入500滋l结合缓冲液,加入5滋lAnexin鄄V鄄FITC及5滋lPI染液混匀,避光488nm,530nm处检测FITC,575nm检测PI,统计细胞凋亡情况。

孵育10min。流式细胞仪检测凋亡情况,激发波长

图1摇miR鄄411鄄3p与PAK2靶向调控关系验证Fig.1摇

ConfirmationoftargetingregulatoryrelationsbetweenmiR鄄411鄄3pandPAK2

表1摇qRT鄄PCR引物Tab.1摇qRT鄄PCRprimer

miR鄄411鄄3pGSK3茁Wnt1茁鄄cateninE鄄cadherinN鄄cadherin

U6GAPDHGenes

F:GTGGCGATGGGGAGTACTATTR:CATCTGACGTCGGAATTGCGTF:GGACAGTGGTGTGGATCAGTR:CCGAAAGACCTTCGTCCAA

Sequences(5忆鄄3忆)

Note:ComparedwithNCgroup,*郾P<0郾05郾

F:CGATGGTGGGGTATTGTGAACF:GCTGACCAAACTGCTAAATGACGAF:CATAAACGAGGTTCTGTCTTCAR:GATAGCCGGACTAGGGATGCF:ACATGGCTGGGGTGTTGAAF:AAGACAATGACTACGTGTAGR:GGATAATAGTCGGGAGGTGR:TGTAGGGTCCCAGCGGTACAAR:CCGGATTTTGGCGTATCAGAC

R:GTACAACACATTGTTTCCTCGGAR:AAGAGAGGCATCCTCACCCT

F:AAAGCAAATCATCGGACGACC

图2摇各组miR鄄411鄄3p及PAK2表达情况

Fig.2摇ExpressionsofmiR鄄411鄄3pandPAK2ineachgroup

Note:ComparedwithNormaltissue,*郾P<0郾05郾

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2郾3摇过表达miR鄄411鄄3p或沉默PAK2对上皮间质转化的影响摇qRT鄄PCR及Westernblot检测结果显示,与阴性对照组相比,miR鄄411鄄3p过表达或沉默PAK2可抑制Wnt信号通路相关因子(Wnt1,茁鄄catenin)及N鄄cadherin表达,促进E鄄cadherin及GSK3茁表达,且联合组效果更为显著(P<0郾05),抑2郾4摇各组细胞活力检测结果摇CCK8检测各组细胞生长活力情况显示,与阴性对照组相比,上调miR鄄411鄄3p表达或抑制PAK2表达可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的生长活力且联合处理效果更为显著(P<0郾05)。抑制miR鄄411鄄3p表达可显著提高口腔2郾5摇各组细胞划痕愈合情况检测摇与阴性对照组鳞状细胞癌细胞活力(P<0郾05),见图4。制miR鄄411鄄3p表达则效果相反,见图3。

相比,miR鄄411鄄3pagomir组及PAK2shRNA组划痕愈合率显著下降,且联合组效果更为明显(P<著上升(P<0郾05),见图5。

0郾05),miR鄄411鄄3pantagomir组细胞划痕愈合率显2郾6摇各组细胞侵袭情况检测结果摇与阴性对照组相比,miR鄄411鄄3pagomir组及PAK2shRNA组细胞侵袭明显减少,且联合组效果更显著(P<0郾05),miR鄄411鄄3pantagomir组细胞侵袭为显著增加(P<0郾05),见图6。

2郾7摇各组细胞凋亡情况检测结果摇与阴性对照组相比,miR鄄411鄄3pagomir组及PAK2shRNA组细胞凋亡明显著增加,且联合组效果更为明显(P<(P<0郾05),见图7。

0郾05),miR鄄411鄄3pantagomir组细胞凋亡显著减少

图3摇过表达miR鄄411鄄3p或沉默PAK2对上皮间质转化的

影响Fig.3摇

EffectofoverexpressiongmiR鄄411鄄3psilencingPAK2onepithelial鄄meseorchymaltransition

Note:ComparedwithNegativecontrolgroup,*.P<0郾05;comparedwith

miR鄄411鄄3pagomir+PAK2shRNAgroup,#郾P<0郾05郾

图5摇各组细胞划痕检测结果

Fig.5摇Resultsofscratchhealingexperimentineachgroup

Note:ComparedwithNegativecontrolgroup,*郾P<0郾05;comparedwith

miR鄄411鄄3pagomir+PAK2shRNAgroup,#郾P<0郾05郾

图4摇各组细胞活力检测结果

Fig.4摇Cellviabilitytestresultsineachgroup

Note:ComparedwithNegativecontrolgroup,*郾P<0郾05;comparedwith

miR鄄411鄄3pagomir+PAK2shRNAgroup,#郾P<0郾05郾

图6摇各组细胞Transwell检测结果

Fig.6摇ResultsofTranswellassayineachgroup

Note:ComparedwithNegativecontrolgroup,*郾P<0郾05;comparedwith

miR鄄411鄄3pagomir+PAK2shRNAgroup,#郾P<0郾05郾

Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.麦明思等摇miR鄄411鄄3p靶向PAK2介导Wnt信号通路对口腔鳞状细胞癌侵袭和转移的影响及调控机制摇第17期·2113·

411鄄3p在口腔鳞癌细胞中同样发挥抑癌因子作用,通过抑制PAK2基因及激活Wnt信号通路发挥作素,茁鄄catenin大量积聚是引发Wnt通路激活及肿瘤发生的关键原因[20]。糖原合成酶激酶鄄3茁(glycogensynthasekinase鄄3茁,GSK鄄3茁)在Wnt通路中起调控开关作用,能够促进茁鄄catenin磷酸化及转录过程调控[21]。研究证实口腔鳞癌中GSK鄄3茁失活,在口腔鳞癌、鼻咽癌等恶性肿瘤中均发挥抑癌因子作

图7摇各组细胞凋亡情况

Fig.7摇Cellapoptosisineachgroup

Note:ComparedwithNegativecontrolgroup,*郾P<0郾05;comparedwith

miR鄄411鄄3pagomir+PAK2shRNAgroup,#郾P<0郾05郾

用。Wnt信号通路的异常激活是肿瘤发生的重要因

411鄄3p或沉默PAK2表达可促进GSK3茁表达,抑制Wnt通路激活,延缓口腔鳞癌进展。上皮间质转化在恶性肿瘤浸润转移中的作用备受关注。上皮间质

用[22]。本研究发现,相对于阴性对照组,激活miR鄄

转化主要表现为间质表型神经性钙黏蛋白N鄄cadherin表达上升及上皮表型钙黏蛋白E鄄cadherin丢失,在包括口腔癌在内的多种恶性肿瘤中均发现E鄄cadherin表达降低、N鄄cadherin表达增高[23]。本cadherin表达上调,N鄄cadherin表达降低,表明过表达miR鄄411鄄3p或沉默PAK2可减少口腔鳞癌上皮间质转化。进一步通过MTT、划痕愈合实验、Transwell实验等对各组细胞的增殖活性、迁移和侵袭能力进行检测发现,抑制miR鄄411鄄3p能够显著增强细胞活力及迁移和侵袭能力,而激活miR鄄411鄄3p或沉默PAK2表达则能够显著抑制细胞活力,减少癌细胞迁移和侵袭。流式细胞术进一步证实过表达miR鄄411鄄3p及沉默PAK2在促进癌细胞凋亡中的重要价值。

综上所述,本研究发现miR鄄411鄄3p能够靶向抑制PAK2表达,通过影响Wnt信号通路的活性调控口腔鳞状细胞癌的生物学特性进行调控。过表达miR鄄411鄄3p能够显著抑制口腔鳞癌细胞增殖、侵袭和转移,促进癌细胞凋亡,miR鄄411鄄3p有望成为口腔鳞状细胞癌靶向治疗的重要分子靶点。

研究发现激活miR鄄411鄄3p或沉默PAK2后E鄄

3摇讨论

口腔鳞状细胞癌是指不同程度鳞状分化、合并上皮侵袭性的肿瘤,也是口腔恶性肿瘤中最为常见的类型

[11]

定进展,但患者的5年生存率仍然较低,尤其是晚期合并远处转移的患者,常规手术、放化疗等治疗方式效果均不理想

[12]

。尽管近年来针对该病的治疗取得了一

。本研究从基因靶向治疗的角度

出发,探讨miR鄄411鄄3p对口腔鳞癌细胞侵袭转移的影响及其作用机制,发现miR鄄411鄄3p可靶向PAK2基因介导Wnt信号通路进而调控口腔鳞癌细胞的生物学特性。

研究证实PAK2活性在多种肿瘤细胞中显著升高,且PAK2高表达与肿瘤的预后不良有关。Zhang等

[5]

预后研究发现PAK2高表达与药物治疗管腔性

[13]

乳腺癌不良相关。抑制PAK2表达可抑制皮肤黑色素瘤细胞增殖

细胞系迁移和侵袭能力肿瘤分级相关

[7]

。下调PAK2表达可抑制卵巢癌

[14]

也证实PAK2在口腔鳞癌组织中表达显著上升且与及Westernblot检测发现,相对于正常口腔黏膜组织,癌组织中PAK2表达显著上升,与既往研究结论一致。本研究证实miR鄄411鄄3p是PAK2的靶向miRNA,在口腔鳞癌中表达显著下降。既往研究证Bai等[15]在关于胃癌的研究中发现,miR鄄411能够抑制胃癌细胞增殖和迁移。miR鄄411能够延缓膀胱癌进展[16,17]。miR鄄411在卵巢癌和宫颈癌中可抑制肿瘤细胞增殖,延缓癌症进展[18,19]。

本研究在前人研究的基础上进一步发现miR鄄实miR鄄411在多种癌症中均发挥抑癌因子作用。

。本研究通过免疫组化、qRT鄄PCR

。关于口腔鳞癌的研究

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