层析分离技术.

色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。 按固定相的基质（载体）类型分类：

层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。

色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。

用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。 层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。

高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。

色层分离过程包含两部分：

固定相：载体或载体+功能基团 流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。

液相色谱的基本原理和参数 保留时间(tR)和保留体积(VR)

从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用VR表示。 VRtR•F理论塔板数的计算公式为：N(tR)2

容量因子k 和平衡常数K

某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。而平衡常数K为平衡时，物

物质在固定相的量(qs)物质在固定相的浓度(qs/Vs) K

物质在流动相的量(qm)物质在流动相的浓度（qm/Vm)Vs和Vm分别为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有 qsVsk'K qmVmqsk' 溶质在固定相停留的时间分数=

qsqm1k'qm1溶质在流动相停留的时间分数

qsqm1k'质在两相的浓度比：k' 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( u b)总是小于流动相的移动速度( u m)，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：ubum(1) 1k'而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反

oubtR0(1k')比：  tRtRumtR0当柱外死体积可忽略不计时，VRVm VRVmVmk'VmKVs 0'tRtRtRtR k'0100tRtRtR0tttR柱效率： 塔板高度（H）和塔板数（N）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。 塔板高度（H）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。 理论塔板数的计算公式为： N  ( t R ) 2 式中tR为标准偏差。

 L 式中， L  柱长。 理论塔板高度为： H

VR0 Vmk'tR0R10tRtR0R'tRN1 / 6

塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。 影响柱效的因素

（1）理论塔板高度随填料粒度减少而减少； （2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效； （3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于柱高减小； （4）分子量较小的样品分子 柱高较小。 色层分离的类型 凝胶筛分 离子交换 反向色谱

疏水色谱（层析） 亲合色谱（层析）

凝胶过滤层析（体积排阻色谱） Gel filtration chromatography,GFC Size exclusion chromatograpy，SEC

是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大小进行分离的层析技术。

应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离和

除盐。一般用作原料液的初分离，获取 几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。

分离原理：

含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分离的目的。

凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：

（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。

（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围；

（4）机械强度高，允许较高的操作压力。 常用的分离介质 天然及高分子介质

经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。 （一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

⑴Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。 （二）琼脂糖凝胶：

商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。 （三）聚丙烯酰胺凝胶：

是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加

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工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。 四）聚苯乙烯凝胶

商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。

凝胶过滤的特点是：

填料多为带有羟基、但不带电荷的惰性材料，亲水性能好，又不与待分离物质发生作用，因此分离条件温和，蛋白质回收率高，重现性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大可分离几百到数百万分子量；设备简单、易于操作，周期短。填料再生性好，可连续使用数百次到上千次。 功能

脱盐：分离大小两类不同的分子即无机盐与生物大分子； 分级：将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离。 缺点：凝胶强度低，可耐受的压力通常低于0.2个大气压，故流速低，通常的线速度小于20cm/h。因此，处理速度较慢。但Superdex的最大耐受压力可达15个大气压，流速也提高近10倍。 无机填料：

表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以外的其他效应。

优点：可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。具有较高的柱效率和分离度。

缺点：pH的适用范围窄。以硅胶为基质的填料，pH范围在2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速率加快，减少柱子寿命。凝胶特性参数 （1）排阻极限（exclusion limit):

凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。不同的凝胶过滤介质品牌具有不同的排阻极限。Sephadex G50的排阻极限是30kD。 （2）分级范围（fractionation range):

即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G-50的分级范围为1.5 ~30kD. （3）溶胀率：

某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即

（溶胀处理平衡后重量干燥重量）溶胀率100%干燥重量 Sephadex G50 的溶胀率为500%30%。 （4）凝胶粒径：

一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。

软凝胶粒径较大，一般为50 ~ 150m，硬凝胶粒径较小，一般为5 ~ 50 m。Sepharose 和Sephadex凝胶粒径分布为45 ~ 165 m，而Superdex 和TSK Toyopearl HW系列可小到20 ~ 40 m，甚至6 ~ 10 m。

（5）床体积（bed volume）

即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。Sephadex G50的床体积为9 ~ 11cm3/g干胶。 （6）空隙体积（void volume)

指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。一般使用相对分子质量为2000kD的水溶性兰色葡聚糖。影响分离特性的因素 1、填料

分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比是选择填料要考虑的首要问题。

目前TSK系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱，其特点是分离度高和吸附性小。 2、柱长

体积排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，因此应根据分离的要求确定柱长，一般柱

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长60-120厘米对于蛋白质的分离比较理想，而长30厘米的柱子多用于快速分离。 3、洗脱液

洗脱液的pH值和离子强度都将影响到分离效果。以硅胶为基质的填料，pH范围在2.0-7.5,如果超出这个范围，将会使键合相的有机层溶解。当离子强度很低时，TSK系列凝胶柱上的硅醇基会与待分离的蛋白发生离子反应，一般通过加入0.3-0.5mol/L的NaCl来抑制。蛋白质和柱填料的疏水作用一般通过加入5-10%的乙醇或异丙醇来控制。 3、流速

是影响蛋白质分离的重要因素。一般流速低分离效果好。如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.5-1.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。 4、样品容量

进样体积和样品浓度将明显影响到蛋白质的分离度，高浓度、小体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.01-0.5%，样品体积是柱体积的1-3%。 凝胶筛分的应用 1、分离纯化

GFC可用于相对分子量从几百到百万的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒（50-400nm）的分离与分析中频繁使用的液相层析法。 2、脱盐

盐析沉淀中得到的高盐浓度的蛋白质溶液用凝胶法脱盐后，可用于其它层析过程。 也可用于缓冲液的置换。 3、相对分子量的测定

通过分子量与分配系数的线性关系进行测量，对球形分子较准确。 4、用于包含体的复性 实验技术

（一）层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─ 10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 分级分离时柱高与直径之比为20:1─100:1，层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。 （二）凝胶的选择

根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-200的吸水量为20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度小分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。 （三）凝胶的制备

商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大加速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。 （四）样品溶液的处理

样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。 （五）防止微生物的污染

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交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有: 叠氨钠（NaN3）：在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。

可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01- 0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。 ⑶乙基汞代巯基水杨酸钠： 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。

（4）苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。 GFC分离的优点：

（1）由于溶质不与介质发生作用，可采用恒定洗脱法洗脱，操作条件温和。回收率可达100%； （2）使用后，不需要进行柱子的清洗和再生，利于循环使用；

（3）作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切率小，蛋白活性回收率高；

（4）分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。 缺点

（1）选择性低，料液处理量小；

（2）洗脱展开后产品被稀释，因此还需要具有浓缩作用的单元操作。 ◎色层分离技术2 反相作用色谱

反相色谱(revelsed phase chromatography，RPC)是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高。

固定相： 用短链烷基(如C4，C8，苯基)和长链烷基(如C18,C22)改性的孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相。

流动相：有机溶剂主要是乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等。有机溶剂和水组成的洗脱体系可以得到高的蛋白回收率。流动相的洗脱强度是随着有机溶剂的强度增加而增加。其次序为：乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃。 实验表明:

烷基链长对蛋白质的反相保留没有显著的影响，但在蛋白质的活性回收上短链烷基(如C4, C8，苯基)和长链烷基(如C18，C22)反相填料是有区别的。表现在烷基链越长，固定相的疏水性越强，因而为使蛋白质较快洗脱下来，需要增加流动相的有机成分；过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸附和生物活性的损失。

应用领域：蛋白质、多肽、核糖核酸、脱氧核糖 核酸、信息核糖核酸等的分离和制备。 ◎疏水作用层析（色谱） 一、原理

疏水作用层析（HIC)：是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 二、疏水性吸附剂

将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基：

苯基、短链烷基（C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特点：

疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基较疏水性低的配基修饰密度低。一般配基修饰密度在10 ~ 40mol/ml，配基修饰密度过小则疏水性吸附不足，密度过大则洗脱困难。

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三、HIC操作

上样及洗脱的一般规律：

在高盐浓度条件下，蛋白质与固定相疏水缔合；浓度降低时，疏水作用减弱，逐步被洗脱下来。一般用pH 6-8的盐水溶液[如（NH4）2SO4]。盐的浓度影响蛋白质的疏水性，从而影响蛋白质的保留值。盐：Na2SO4，KH2PO4，NaHPO4，(NH4)2SO4，NH4OAc，KOAc，NaOAc，NaCl

盐析作用增强 洗脱能力增强

1、影响疏水性吸附的因素

蛋白质的疏水性与其荷电性质相比复杂得多，不易定量掌握。除疏水性吸附剂的性质(疏水性配基的结构和修饰密度)外，流动相的组成以及操作温度对蛋白质疏水性吸附的强弱均产生重要影响。

(1)离子强度及种类

蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大。离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。疏水性吸附与盐析沉淀一样，在高价阴离子的存在下作用力较高。因此HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。 (2)破坏水化作用的物质

SCNClO4I 等离子半径较大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子之间相互

2SO42HPO4 等)的作用

作用。这类阴离子与上述盐析作用强的高价阴离子(如

正好相反，前者称为离液离子(chaotropic ion)，后者称为反离液离子(antichaotropic ion)。在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。

除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱促进剂，洗脱疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱的高疏水性蛋白质。 (3)表面活性剂

表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗脱分离。但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜：浓度过小则膜蛋白不溶解，过大则抑制蛋白质的吸附。 (4)温度

一般吸附为放热过程，温度越低吸附结合常数越大。但疏水性吸附与一般吸附相反，吸附结合作用随温度升高而增大。蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸热过程，H即疏水性吸附为吸热过程, 0 dlnKH因为： 2dTRT

所以吸附平衡常数K随温度的升高而增大。 2，蛋白质的分离

蛋白质与HIC填料之间的作用很复杂，有时不能完全用疏水性相互作用来解释，有时配基苯环还会与蛋白质分子上的芳香族氨基酸产生-键。因此，在利用HIC分离蛋白质混合物时，需事先利用各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验，确定最佳吸附剂和洗脱剂。

3，HIC的特点

HIC主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化。虽然HIC不如IEC应用昔遍，但可作为IEC的补充工具。如果使用方法适当，HIC具有与IEC相近的分离效率．归纳而言，H1C具有如下特点：

(1) 由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此，HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液； (2) 可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力，因此此可根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂；

（3） 疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。

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