析
苏明权，岳乔红，周萍，段艳，杨柳，杨军兰，刘家云，郝晓柯
【关键词】 结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA
Preparation and antigenicity assay of recombinant proteins of Mycobacterium tuberculosis
【Abstract】 AIM: To clone and express the Mr 16×103 and Mr 38×103 proteins of Mycobacterium tuberculosis in E. coli， and to characterize its antigenicity and specificity. METHODS: The Mr 16×103 and Mr 38×103 antigen genes were amplified from Mycobacterium tuberculosis genome DNA by polymerase chain reactions and cloned into pGEX4T2 expression vector after sequencing. BL21 strain of was transformed with the recombinant vectors and induced to express recombinant proteins. The proteins were purified by affinity column chromatography. The antigenicity and specificity of purified proteins were estimated by enzymelinked immunoabsorbant assay. RESULTS: The BL21 strains of E. coli with recombinant vectors showed 42％ and 18% of Mr 16×103 （688 mg/L） and Mr 38×103 （217 mg/L） gene expressions after
induction. The sensitivity of Mr 16×103 and Mr 38×103 proteins were ％ and ％, specificity were 100％ and 99％，accuracy were ％ and ％ respectively. CONCLUSION: The expressions and purifications of recombinant Mr 16×103 and Mr 38×103 antigens with good antigenicity and specificity facilitate their research and clinical application in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis.
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis； antigen； gene expression； enzymelinked immunoabsorbant assay
【摘要】 目的：克隆表达结核分枝杆菌Mr 16×103和Mr 38×103重组蛋白，测定其抗原性和特异性. 方式： 利用聚合酶链反映自结核分枝杆菌基因组DNA扩增Mr 16×103和Mr 38×103抗原基因，经测序鉴定后克隆于pGEX4T2表达载体，转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其抗原性与特异性. 结果：携带重组质粒的菌株经诱导产生的表达量别离为42％和18％；Mr 16×103和Mr 38×103蛋白量别离为：688 mg/L和217 mg/L. 其中Mr 16×103蛋白作为包被抗原ELISA法检测的灵敏度为％, 特异性为100％, 准确性为％；Mr 38×103蛋白作为包被抗原ELISA检测的灵敏度为%,特异性为99%，准确性为%. 结论：以Mr 16×103，Mr 38×103重组蛋白为抗原具有良好的抗原性和特异性，可用于结核分枝杆菌诊断方式的
成立及临床诊断.
【关键词】 结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA
【中图号】 R378
0引言
结核病仍是目前危害全世界人类健康的重要传染病，我国每一年约有13万人因结核病而死亡. 对结核病的实验诊断要紧依据细菌学检查和血清学检测，细菌学检查繁琐费时，培育周期长，达不到快速诊断的目的，血清学检测是一种方便快捷的实验室诊断方式，血清学检查的关键是结核分枝杆菌特异性抗原的提呈. 咱们利用基因工程重组方式，通过大肠杆菌表达结核分枝杆菌的Mr 16×103和Mr 38×103蛋白，以Mr 16×103和Mr 38×103重组蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附实验测定两种抗原的反映性和特异性，以期证明其在血清学诊断中的价值.
1材料和方式
材料结核分枝杆菌H37RV标准株（菌株号：ATCC27294）：购自卫生部国家菌种保留中心. DH5α， BL21由第四军医大学西京
医院查验科保留；T4连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ, EcoRⅠDNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Vitagene公司；GST亲和层析柱GSTrapFF购自Pharmacia公司；pGEX4T2表达载体购自Pharmacia公司.
方式
结核分枝杆菌Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因的PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv培育物经煮沸灭活，蛋白酶K消化留宿，经酚. 氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA. 通过PCR扩增Mr 16×103，Mr 38×103基因. Mr 16×103抗原基因引物为： 5′AGGGGATCCATGGCCACCACCCTTCCCGTTCAG3′含BamH I酶切
位
点
和
起
始
密
码
子
，
5
′
TCAGCTCGAGCCCAGTGGTCAGTTGGTGGACCG3′含Xoh I酶切位点和终止密码子，预期扩增产物435 bp. Mr 38×103基因引物为：5′AGGGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATACGCT3′含BamH I酶
切
位
点
和
起
始
密
码
子
，
5
′
GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG3′含Xoh I酶切位点和终止密码子，预期扩增产物1122 bp. PCR反映程序为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min. 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果.
基因的克隆与鉴定用胶回收试剂盒回收目的片段，将Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因与质粒pGEX4T2同时用BamH I与Xoh I双酶切，T4连接酶连接，重组质粒转化 DH5α感受态细胞. 利用Vitagene公司提供的小量质粒提取试剂提取质粒DNA，序列测定由上海生工生物工程公司完成.
表达载体的构建将携带Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因的重组质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收基因片段，Vitagene公司凝胶抽提试剂盒纯化，连接于双酶切的pGEX4T2表达载体，T4 DNA连接酶连接，转化于 DH5α感受态细胞. 挑选单菌落，抽提质粒，酶切检测，并进行序列测定以证明插入序列是不是正确. 挑选测序正确的重组表达载体质粒，再转化于BL21菌株.
重组质粒的诱导表达及纯化将携带重组表达载体的BL21菌株接种于含氨苄青霉素 g/L的LB培育基，37℃振荡培育留宿. 然后从中取1 mL接种于100 mL新鲜含氨苄青霉素的LB液体培育基， 37℃振荡培育3 h，加人诱导剂IPTG至终浓度 mmol／L，37℃继续培育5 h. 离心搜集菌体. 将诱导前后的样本各加入2×样品缓冲液100 μL，95℃滚水浴10 min，10 000 g离心10 min，取10 μL上清进行120 g/L SDSPAGE. 凝胶用考马斯亮蓝染色2 h，脱色3～5 h，观看目的蛋白，用CS9000薄层扫描仪在580 nm波长下对SDSPAGE蛋白电泳凝胶上的蛋白条带进行扫描，确信菌体总蛋白中目的蛋白比例.
用GSTrap FF蛋白纯化柱和凝血酶进行目的蛋白的纯化，按试剂盒说明书进行，取得纯化的重组结核杆菌Mr 16×103，Mr 38×103蛋白用SDSPAGE蛋白电泳进行检测.
16×103，Mr 38×103重组蛋白抗原的ELISA检测对西安地域搜集的94份血清样品进行ELISA检测，其中肺结核患者血清90份（经集菌涂片染色法或培育实验证明为结核分枝杆菌阳性），正常健康人血清100份为阴性对照. 将纯化Mr 16×103，Mr 38×103抗原溶液稀释于PBS溶液，37℃包被酶标板2 h. PBST溶液（PBS内含 g/L Tween20）洗涤，再用封锁液（PBST内含1 g／L牛血清清蛋白)37℃封锁1 h，然后用PBST溶液洗涤. 加入1 μL血清样品，37℃温育1 h，PBST溶液洗涤. 加入1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃温育30 min. 加入四甲基联苯胺显色液，室温显色30 min后终止反映. 450 nm检测吸光度值.
2结果
目的基因的扩增与克隆用蛋白酶裂解法提取的结核杆菌基因组DNA用特异的引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，证明所取得的PCR产物为目的基因片断，与在GenBank中查到的结核分枝杆菌Mr 16×103，Mr 38×103蛋白的基因大小大体一致（图1）. 提取质粒，别离经双酶切后，取得435 bp和1122 bp的目的基因片段和
载体pGEX4T2的4950 bp片断，而空质粒对照只取得一条4970 bp左右的片段（图2）. 经测序证明目的基因的序列完全正确，未发生突变. 图1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳（略）
1,2: 空质粒pGEX4T2的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切结果; 3: DNA分子量标准; 4,5: 重组质粒pGEX16的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切结果; 6,7: 重组质粒pGEX38的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切结果.
图2重组质粒pGEX16和pGEX38的酶切鉴定（略）
表达载体构建与重组蛋白诱导表达进一步测序说明， pGEX16及pGEX38中的插入序列及读码框架正确. 将测序正确的pGEX16， pGEX38和pGEX4T2别离转化感受态 DH5α，在37℃用 mmol/L IPTG诱导后，别离取菌株进行120 g/L SDSPAGE. 结果说明，pGEX16转化的菌株在Mr 42×103处显现一条新生蛋白条带，pGEX38在Mr 64×103处显现一条新生蛋白条带，均与预期结果一致；而pGEX4T2转化的菌株那么只在Mr 26×103处有一新生条带，说明插入的Mr 16×103蛋白和Mr 38×103蛋白基因已经成功地在大肠杆菌中表达，并与GST形成了融合蛋白（图3，图4）. 对图3，图4中SDSPAGE凝胶上菌体蛋白条带别离进行凝胶薄层扫描分析，表达的融合蛋白GST16，GST38别离约占菌体总蛋白的42%和18%.
图3GST16融合蛋白的原核表达（略）
图4GST38融合蛋白的原核表达（略）
重组蛋白的纯化经蛋白纯化后，经SDSPAGE蛋白电泳检测，可看到单一的纯化蛋白泳带（图5），紫外分光光度仪测量纯化蛋白的浓度：Mr 16×103，Mr 38×103蛋白别离为 688 mg/L和217 mg/L.
二种抗原的ELISA检测依照棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度，以强阳性血清的A值为左右，阴性血清的A值小于的包被抗原稀释度作为工作浓度. 选择Mr 16×103蛋白的工作浓度为10 μg/L，Mr 38×103蛋白的工作浓度为1 μg/L. 以选择好工作浓度的蛋白抗原进行包被，别离检测病例组和对照组血清标本. 结果判定：以空白对照孔（只加蒸馏水200 μL）校零，在波长450 nm处读取各孔的A值，凡样品孔A值：阴性对照孔A值≥，该样品即为阳性. 按检测结果计算各个抗原检测的灵敏度，即实际患病且被诊断实验诊断为患者的概率，那么Mr 16×103蛋白抗原作为包被抗原ELISA法检测的灵敏度为％（63/94），Mr 38×103蛋白抗原灵敏度为％（75/94），再计算各个抗原检测的特异性，即实际未患病被诊断实验诊为非患者的概率，那么Mr 16×103蛋白抗原的特异性为100％，Mr 38×103蛋白抗原的特异性为％. 依照其各自的灵敏度和特异性计算其ELISA
法检测的准确度，Mr 16×103蛋白抗原的准确度为％，Mr 38×103蛋白准确度为％.
图5纯化蛋白的SDSPAGE分析（略）
3讨论
结核菌抗体检测的关键是寻觅有效的抗原成份. 目前发觉的结核分枝杆菌特异性抗原最经常使用的是Mr 38×103抗原，另外有Mr 14×103，Mr 16×103抗原、ESAT6抗原与mtb8l抗原等［1-2］，上述几种抗原在结核杆菌抗体检测中的阳性率均各不相同［3-5］. 因此用基因重组技术制备结核分枝杆菌基因抗原，对结核病的诊断和方式学成立具有十分重要的意义.
Mr 16×103蛋白是一种小分子热休克蛋白，具有家族性的一起特点［6］. 研究发觉MTB Mr 16×103蛋白抗原与结核病的长期暗藏有着紧密的关系. 在培育条件下Mr 16×103蛋白从结核分枝杆菌生长对数期到稳按期具有很高的表达，在稳按期可成为优势生长蛋白，该蛋白在结核分枝杆菌感染宿主初期关于细菌的生长是必需的. Mr 16×103蛋白对结核分支杆菌的生存力和稳固性起着重要的调剂作用，主若是因为它所含有的αcrystallin结构域是所有小分子热休克蛋白的同源序列，且高度保守. 因此在人体感染MTB暗藏期时Mr 16
×103蛋白被以为有利于结核菌的存活，在85%的肺结核病人的血清中都可查到Mr 16×103蛋白［7］. TB Mr 38×103蛋白又叫抗原b（Pab），抗原5，抗原78，是MTB中要紧的抗原，它是一种糖基化的脂蛋白. Andensen等从λgt11 MTB DNA基因文库中分离出编码Mr 38×103蛋白的基因，该基因序列含1122个碱基对，Mr ×103. Mr 38×103蛋白的氨基酸序列与大肠杆菌的磷酸盐结合蛋白(PstS)有30％的同源性，PstS是大肠杆菌磷转运系统中的磷结合蛋白，当磷缺乏时PstS可被激活. 其后Andersen证明Mr 38×103蛋白果然也与磷代谢有关，因在磷饥饿培育条件下，该蛋白被大量诱导［8］. MTB Mr 38×103蛋白是MTB中要紧的抗原，它是一种糖基化的脂蛋白，是MTB特异性抗原，有两个B细胞抗原决定簇.
咱们依照结核分枝杆菌的生长特性，以Mr 16×103，Mr 38×103蛋白进行基因工程表达，在大肠杆菌中成功表达了结核杆菌两种基因重组蛋白，为研究其活性和成立以Mr 16×103和Mr 38×103基因抗原为目标的血清学检测方式提供条件. 以Mr 16×103蛋白为抗原，经ELISA方式检测临床样品中的结核杆菌抗体灵敏度为：%，特异性为：100%，准确性为：%；以Mr 38×103蛋白为抗原，经ELISA方式检测临床样品中的结核杆菌抗体灵敏度为：%， 特异性为： %， 准确性为： %. 实验结果证明，以两种基因重组蛋白为抗原成立结核分枝杆菌血清学检测方式，在结核病诊断上有必然的利用价值，为临床诊断结核病提供切实可行的手腕.
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