超详细免疫荧光染色实验流程~
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发布时间：5小时前
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时间：5小时前
一、取材
注意：预冷PBS，确保在4℃冰箱中放置1-2小时。配置4%PFA时，使用1XPBS，需在通风橱中恒温加热搅拌。灌流时要尽量清除血液残留，确保灌流干净。
步骤：
1. 1XPBS灌流
2. 内固定：使用4%PFA进行灌流
3. 外固定：将组织放入4%PFA溶液中，固定时间为48-72小时
4. 沉糖：将组织置于30%蔗糖溶液中，确保组织沉底后即可进行切片。
二、冰冻切片
注意：底座需预冷10分钟。使用OCT涂抹并切取小脑，便于粘贴在底座上。全脑涂抹OCT后，切片机需冻存大于2小时，冰箱过夜，切片机需提前预冷。
三、免疫荧光染色
步骤：
-20℃冰箱取出切片，室温晾干15分钟。使用PBS清洗三次，每次5分钟。选择性进行抗原修复，5分钟在95℃水浴中进行。使用0.3%TritonX-100透膜5-10分钟。使用PBS清洗三次。使用5%BSA或5-10%FBS封闭切片1小时，室温下或37℃下30分钟。擦干封闭液，滴加一抗，4℃过夜，一般需16小时。次日，使用PBS清洗三次，每次10分钟。使用稀释比例1:500的二抗，室温孵育2小时，注意避光操作；或37℃下1小时。再次使用PBS清洗三次，每次5分钟。擦干切片，使用抗荧光淬灭封片液封片。
四、注意事项
TritonX-100配制后在4℃下保存，可长久使用。从冰箱中取出切片后，避免切片过干。染色过程中，尽量避免切片干燥。
