实验笔记丨实时荧光定量PCR步骤详解
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样本RNA的抽提过程包括以下几个步骤：首先，取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。其次，进行两相分离，向每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡后在4℃下离心15分钟，以实现红褐色酚氯仿相、中间层以及无色水相上层的分离。RNA主要分布在水相中，体积约为加入TRIZOL试剂的60%。接着，RNA沉淀的形成，将水相上层转移到干净无RNA酶的离心管中，加等体积异丙醇以沉淀RNA，混匀后在4℃下离心10分钟。沉淀在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。随后，进行RNA的清洗，将上清液移去，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后在4℃下离心5分钟。最后，RNA的干燥与溶解，小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。将RNA溶解于无RNA酶的水中，40μl的DEPC水中加入5ul，用反复吹打以确保完全溶解。此溶液保存于-80℃待用。
RNA质量检测包括紫外吸收法测定和变性琼脂糖凝胶电泳测定。紫外吸收法下，A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。通过计算可得样品RNA浓度和纯度。取5ul RNA溶于40 ul DEPC水中，1:100稀释后测得A260 = 0.21，RNA浓度计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ug/ml。具体计算示例为：RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul。剩余样品RNA总量为：35 ul × 0.84 ug/ul = 29.4 ug。纯度检测通过计算A260/A280的比值，比值范围应为1.8到2.1。
变性琼脂糖凝胶电泳测定包括制胶、准备RNA样品、电泳和紫外透射光下观察并拍照。制胶后，将凝胶板放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，预留加样孔至少可以加入25 ul溶液。准备RNA样品时，取3ugRNA，加入甲醛上样染液，加热至70℃孵育15分钟使样品变性。电泳前需预电泳5min，将样品加入上样孔。在5-6V/cm电压下电泳2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。在紫外透射光下观察并拍照，可观察到28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓，28S核糖体RNA带的密度大约是18S的两倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，由tRNA和5S核糖体RNA组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
样品cDNA合成包括反应体系、混合液处理和逆转录过程。反应体系包含逆转录buffer、上游引物、下游引物、dNTP、逆转录酶MMLV和RNA模版，总体积为10μl。混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
实时定量PCR包括β-actin阳性模板的标准梯度制备、反应体系和管家基因反应体系的配置，以及PCR反应条件。标准品反应体系和管家基因反应体系的配置包含SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP、Taq酶、阳性模板DNA或待测样品cDNA、ddH2O等，总体积分别为50μl和50μl。所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系，配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件包括93℃2分钟预变性，随后按93℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟，共40个循环，最后72℃7分钟延伸。
引物设计和电泳步骤包括引物设计原则、各样品的目的基因和管家基因的Realtime PCR反应，以及PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色后的检测。
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